Características Biológicas de CaIChRI41R1 y TrMnPR4

La selección de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 se fundamentó en su versatilidad biológica para sintetizar fitohormonas, solubilizar hierro y fósforo y fijar nitrógeno, lo que las hace promisoras para generar un paquete tecnológico dirigido a promover la germinación, crecimiento y desarrollo de diferente material vegetal de especies forestales bajo condiciones de vivero. La primera característica biológica determinada para CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 fue la síntesis de AIA, la cual indicó la capacidad de las dos bacterias de sintetizar dicha hormona con o sin adición de Triptófano al medio de crecimiento. Patten y Glick (2002) reportaron la producción de AIA por la bacteria Pseudomonas putida en medio enriquecido con triptófano. Ahdmad et al. (2005), reportaron aislamientos de los géneros Klebsiella sp., Azospirillum sp.,

Pseudomonas sp. y Azotobacter sp, productores de AIA en medios sintéticos con adición o no de triptófano. La mayoría de estos generos bacterianos presentan características macro y microscópicas en común, como coloración Gram negativa, colonias mucoides y crecimiento y desarrollo sobre medios selectivos como King B y diferenciales como agar SMRS, por lo que dichas características fueron base de selección de los asilamientos endófitos de C. alliodora CaIChRI41R1 y de T. rosea TrMnPR41248, pese a no presentar la mayor producción de ácido indol acético en medio sintético sin adición de L-triptófano. Como parámetro adicional para la selección de los dos aislamientos se tuvo en cuenta la facilidad de su reactivación, crecimiento y mantenimiento en condiciones de laboratorio y la homogeneidad de su crecimiento en medio líquido, puesto que son elementos claves al momento de considerar su escalamiento a nivel industrial.

Ahmad y colaboradores (2005), describieron la capacidad de diversos géneros bacterianos para producir AIA en medios carentes de triptófano exógeno, encontrando aislamientos de Azotobacter sp. con la capacidad de producir de 2.68 µg/ml a 10.80 µg /ml de AIA sin adición de triptofano al medio tras quince días de incubación. Además, encontró aislamientos de Pseudomonas sp. capaces de producir AIA dentro del rango de 5.34 a 22.4 µg /ml bajo las mismas condiciones descritas para Azotobacter sp.

Los dos aislamientos evaluados en este trabajo presentan valores de biosíntesis de AIA similares a los descritos por Ahmad (2005) para Azotobacter sp. y Pseudomonas sp., sin adición de L-triptófano, lo que favorece su implementación en procesos a escala industrial, debido a que el triptófano es una materia prima costosa que restringe la formulación de un inoculante dirigido al sector productivo forestal.

Tanto CaChRI41R1 como TrMnPR41248 corresponden según la caracterización realizada en el Kit Microscan a Pseudomonas

fluorescens/putida (99.99%). Según la clasificación del manual de Bergey (2000) se han descrito cinco biovar de Pseudomonas fluorescens y dos biovar de P. putida con dos subtipos de la especie. CaIChRI41R1 según Microscan® no fermenta la glucosa, teniendo que Bergey cataloga tanto a P. fluorescens y P. putida como degradadoras del azúcar. Por otro lado la utilización de L-arginina como fuente de nitrógeno y la nitrificación de fuentes amoniacales a nitritos y nitratos concuerdan con las características bioquímicas descritas para el género en el manual de Bergey.

En 2002, Sánchez y colaboradores reportaron para la identificación de bacilos gram negativos no fermentadores provenientes de muestras clínicas mediante el sistema Microscan® una alta frecuencia de bacterias del genero Pseudomonas sp., en especial de la especie P. aeroginosa, presentando como datos relevantes una resistencia del 37% a la gentamicina, 28.3% a Ciprofloxacina, 15.8% a imipenem, 24.1% a cefepime y 32.5% a amikacina. Dichos resultados concuerdan con los de este trabajo para el aislamiento CaIChRI41R1 y TrMnPR41248.

Muthukumarasam y colaboradores (2002), describen aislamientos endófitos capaces de fijar nitrógeno, lo que concuerda con la actividad nitrogenasa detectada para CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 mediante ARA. Trabajos previos realizados en el Laboratorio de Asociaciones suelo-planta microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana, por Cruz y Neira (2004), describen una actividad nitrogenasa de Azospirillum brasilense ATCC 29710 en caldo nutritivo con y sin triptófano a las 18 horas de crecimiento de 72.91 nmoles etileno/h*frasco

y un promedio de 4061.01 nmoles etileno/h*frasco en células de A. brasilence inmovilizadas en alginato, adicionalmente Christiansen-

Weninger & Van-Veen (1991), citados por James et al., 2001), reportan una actividad nitrogenasa de 40 nmoles etileno/h/2kg suelo fresco de A. brasilense asociado a la rizosfera de trigo, los mismos citan a Han &

New (1998), quienes a partir de aislamientos de suelo de trigo encontraron actividad nitrogenasa para cepas de A.brasilense de 39.2nmoles etileno/mg proteina/h en medio NFb y cepas asociadas con raíces de la misma especie una actividad de 2.0 nmoles etileno/ raíz seca/ día. La cepa CaIChRI41R1 fue aislada en el laboratorio en 2004 a través del protocolo de Dobereiner, por lo que su baja actividad fijadora de nitrógeno con respecto a otros microorganismos se deba posiblemente a sus continuos pases por medios sintéticos, por lo que el mantenimiento de su actividad biológica y la potencialización de su capacidad de fijar nitrógeno implicaria su pase por un hospedero vegetal.

De forma adicional a la síntesis de AIA y a la capacidad de fijar nitrógeno, se estableció que CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 crecen en agar pectina, presentan halos de solubilización en agar SMRS y producen pigmentos difusibles en el medio agar King B. William et al. (2001), describieron como la actividad pectinasa sobre tejidos vegetales es característica básica de microorganismos fitopatógenos, debido a que la pectina es la primera línea de defensa de las células vegetales y esta sujeta a cambios estructurales con el fin de evitar la entrada de dichos microorganismos.

Estos cambios suceden como respuesta a una señal elicitora mediada por la degradación de las pectinas a causa de la bacteria inféctante. Pese a lo anterior los dos microorganismos evaluados en este trabajo fuerón inocuos sobre una especie vegetal sustituta y sensible a fitopatógenos bacterianos, por lo que su actividad pectinasa se puede relacionar con propiedades biológicas de las PGPB’s como las respuestas sistémicas inducidas y adquiridas. Lo anterior ha sido reportado por Van loon et al. (1998, citado por Bloemberg et al., 2001), quienes encontrarón varias rizobacterias no patógenas del género Pseudomonas sp, con la habilidad de inducir un estado de resistencia sistémica en las plantas, lo que provee protección contra un amplio espectro de organismos fitopatógenos dentro de los que se incluyen hongos, bacterias y virus.

Por otro lado Huang (1986) y Quadt-Hallman et al. (1997), citados por Sturz y colaboradores (2000), describen mecanismos activos de entrada de endófitos bacterianos a células vegetales mediante la hidrólisis de las paredes celulares por acción enzimática, dentro de la cual la actividad pectinasa es una de las más importantes (William, 2001). Hurek et al. (1994), señalan la presencia de enzimas celulolitícas y pectinoliticas producidas por numerosas bacterias endófitas dentro de las cuales esta Pseudomonas fluorescens. La degradación enzimática de las paredes celulares por los géneros bacterianos descritos anteriormente fue observada únicamente cuando la epidermis de las raíces fue colonizada pero nunca tras la colonización de los espacios intracelulares del cortes de la raíz, lo que sugiere que la producción de este tipo de enzimas esta regulada de forma especifica para la penetración de un hospedero vegetal (Sturz et al. 2000). El reaislamiento de bacterias endófitas a partir de raíces de plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea utilizadas en el presente trabajo con características morfológicas macro y microscópicas similares a las de los dos aislamientos inoculados y evaluados, sugiere su posible entrada y establecimiento en la plantas 120 días tras la inoculación, lo que puede ser debido en parte a la actividad pectinasa de los dos aislamientos.

Además, esta actividad pudo tener un efecto positivo sobre variables de crecimiento vegetal como los pesos frescos y longitud del sistema radical de las plantas evaluadas, puesto que la hidrólisis de las paredes celulares de las raíces permite la entrada de agua a estas y genera presión sobre los tejidos, lo que favorece su elongación (Taiz & Zeiger, 2002). Además de la actividad pectinasa de los dos aislamientos evaluados, su posible actividad fosfato solubilizadora es otra característica biológica de importancia como bacterias promotoras de crecimiento vegetal.

Mehta y Shekhar (2001) y Pallai (2004), reportaron que la producción de zonas claras y/o transparentes alrededor de colonias bacterianas rizosféricos sobre medios de cultivo selectivos como el Pikovskaya, SMRS y NBRIP indican la presencia de organismos fosfato solubilizadores. Los anteriores reportes concuerdan con lo observado sobre el medio SMRS para los dos aislamientos seleccionados, donde se observaron zonas claras alrededor de las colonias bacterianas transcurridas tres horas de sembrados los microorganismos en el medio. Así, estos resultados son de gran importancia, debido a que numerosas bacterias con estas características han sido utilizadas en la preparación de inóculos de fosfato solubilizadoras, que promueven el crecimiento y desarrollo de plantas de interés económico (Subba, 1993; Tilak, 1993 citados por Mehta y Sheckhar en 2001).

Autores como Raja y colaboradores (2002), reportaron la importancia que presentan las bacterias fosfato solubilizadoras y su interacción con hongos de micorriza arbuscular dentro de los sistemas de producción agrícolas. Esta característica favorecería su utilización conjunta en paquetes tecnológicos durante la propagación de especies de interés forestal. También este tipo de interacción biológica puede constituir una explicación para el buen comportamiento de la coinoculación de CaIChRI41R1 + G.manihotis y TrMnPR41248 + G. manihotis sobre las variables de crecimiento evaluadas en C. alliodora y T. rosea, en especial en esta última para el desarrollo de su sistema radical y acumulación de biomasa. Además, la posible relación sinérgica observada entre bacterias y HMA, constituye una herramienta clave en el establecimiento de los microorganismos en los suelos, puesto que la presencia de la bacteria influyó en el establecimiento del hongo micorrícico, presentando valores altos de infección y de número de esporas, lo que posiblemente se pueda deber a la síntesis de hormonas como AIA por la bacteria. Los tratamientos de coinoculación de HMA + AIA (producto comercial) también presentaron valores significativos sobre la infección con hongos

de micorriza tanto de C. alliodora como de T. rosea. El anterior comportamiento ha sido descrito por autores como Barea y colaboradores (2005), quienes describen relaciones sinérgicas entre HMA y bacterias fosfato solubilizadoras para la captación de P por la planta y por Garbaye (1994), quien define la presencia de bacterias ayudadoras de micorriza (MHB, mycorrhiza-helper-bacteria), las cuales estimulan el crecimiento micelial del hongo y favorecen la formación de la simbiosis.

Además de la solubilización de fosfatos, las bacterias ayudadoras de la micorriza, como Pseudomonas fluorescens, pueden presentar producción de sideróforos. Los aislamientos CaIChRI41R1 y TrMnPr41R248 produjeron pigmentación en medio King B lo que se relaciona con la producción de sideroforos microbianos del tipo pioverdinas. Marschner y Romheld (1994) reportaron que las plantas utilizan sideróforos sintetizados por sus microorganismos rizosféricos, como fuente de hierro soluble. Cowley et al. 1988; Bar-ness et al. 1991 y Cline et al. 1984; muestran como plantas de pepino tienen la capacidad de crecer en presencia de sideróforos microbianos, lo que implico un incremento en su biomasa y su contenido de clorofila en suelos con baja disponibilidad de hierro. Lo anterior resulta de importancia, debido a que los suelos destinados para la siembra de especies forestales en nuestro país presentan en su mayoría un alto grado de deterioró, siendo muy común las limitaciones de elementos esenciales para el desarrollo vegetal como el fósforo, nitrógeno, hierro entre otras.

7.2. Crecimiento de los Aislamientos CaIChRI41R1 y TrMnpr41r248