Caracterización Fenotípica.

Hoy en día, la caracterización de un (bradi)rizobio se basa tanto en los caracteres fenotípicos como genotípicos. De esto modo de acuerdo a Jordan (en Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey 1984) los (bradi)rizobios pueden ser descriptos de acuerdo a su crecimiento en medios de cultivo sólidos o líquidos. Tanto el tamaño, la forma, el color y la textura de las colonias, como así también la capacidad de modificar el pH del medio, son características estables que pueden utilizarse para la caracterización de cepas. Los (bradi)rizobios presentan una temperatura óptima de crecimiento de 25 a 30 °C, en medios de cultivo con pH entre 6 y 7.

Para comenzar nuestra caracterización de los 100 aislamientos de rizobios noduladores de soja realizamos una evaluación de distintos aspectos fenotípicos y fisiológicos. De esta manera obtuvimos una aproximación del tipo de diversidad rizobiana de cada sitio. En esta sección evaluamos los siguientes caracteres:

1. Capacidad de crecimiento a 28 °C y 37 °C.

2. Coloración de las colonias crecidas en YEM-agar suplementado con rojo congo.

3. Acidificación o alcalinización del medio YEM agar suplementado con azul de bromotimol.

III.3.1. Capacidad de crecimiento de las colonias a distintas temperaturas.

Con el fin de evaluar la capacidad de los aislamientos para crecer a temperaturas por encima de la óptima tolerada por los (bradi)rizobios, cultivamos las bacterias en placas de YEM-agar con rojo congo a 28 °C y a 37 °C. La primera temperatura es la normal para el crecimiento de (bradi)rizobios y la segunda no es tolerada por (bradi)rizobios mesófilos, aunque en los suelos puede haber cortos periodos con estas marcas térmicas en zonas expuestas al sol durante el verano. Como se observa en la Tabla III.2, todos los aislamientos fueron capaces de crecer a 37 °C, en contraste con la cepa E109 utilizada como referencia. La colección de (bradi)rizobios presentó un tiempo de formación de nuevas colonias a 37 °C similar al observado a 28 °C. Este resultado sugiere que nuestros aislamientos pueden poseer una ventaja selectiva frente a la cepa utilizada en los inoculantes por su tolerancia a la alta temperatura. La soja es un cultivo de verano, y la formación de los nódulos que más contribuyen a la fijación de N2 total del cultivo ocurre

en las primeras etapas, entre diciembre y febrero, meses que suelen ser muy calientes en las zonas donde se realizaron los muestreos.

III.3.2. Evaluación de la coloración de las colonias en YEM-agar con rojo congo. El medio YEM-agar con rojo congo es uno de los medios de cultivo más utilizados para (bradi)rizobios, por ser indicador para este género de bacterias en base a la baja o nula capacidad de las mismas para absorber el colorante. Como resultado, las colonias de estas bacterias son generalmente blancas con los bordes regulares, pudiendo virar al rojo un cierto tiempo después que se completó el crecimiento debido a la biosíntesis tardía de celulosa. Por lo tanto, dentro de esta característica y dependiendo del (bradi)rizobio, podemos encontrar distintos grados de coloración, incluyendo colonias blancas, opacas, traslúcidas, rosadas y en algunos casos rojas (E. meliloti). La Tabla III.2 nos muestra la distribución del tipo de coloración obtenido en nuestra colección. Si bien es clara la

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diversidad, la mayoría de las cepas presentaron un fenotipo translúcido, a diferencia de E109, que presentó colonias blancas más típicas del crecimiento de B. japonicum en YEM- agar con rojo congo. Estos resultados además indican que la capacidad de sintetizar celulosa está pobremente representada en nuestra colección.

III.3.3. Evaluación de la modificación del pH del medio y la velocidad de crecimiento.

Para observar la capacidad de estas cepas para modificar el pH del medio suplementamos el YEM-agar con azul de bromotimol. Este colorante es utilizado como marcador de pH, dado que su viraje a un color amarillo indica la acidificación del medio, mientras que su viraje hacia el azul se corresponde con la alcalinización. Estas modificaciones en el pH del medio se correlacionan además con la velocidad de crecimiento. Los rizobios como E. fredii, liberan al medio ácidos orgánicos, disminuyendo así su pH. En cambio, los bradirrizobios como B. japonicum liberan al medio cationes que lo alcalinizan. Mediante estas observaciones hemos dividido a los aislamientos en bradirrizobios, en los cuales la presencia de colonias se evidenciaba a partir de los cinco días de crecimiento y el medio viraba al azul, y los rizobios, en los que las colonias fueron visibles en dos días y el medio viraba al amarillo. Como referencias utilizamos a B. japonicum E109 como representante de los bradirrizobios y E. fredii USDA 205 como representante de los rizobios. Cabe destacar que algunos aislamientos no mostraron modificación del pH del medio. En esos casos, no pudimos determinar con certeza si se trataba de bradirrizobios o rizobios (para más detalles, véase Tabla 1 en el apéndice B).

Si realizamos el análisis por viraje de pH, en todos los sitios se obtuvo entre un 45 % y 75 % de aislamientos que dieron color verde (G) excepto para CU que solo mostró un 15 % de esta categoría. El color verde implicaría un pH neutro y por lo tanto no podemos determinar si se trata de bradirrizobios o rizobios. Si analizamos el viraje a pH alcalino, vemos que en Castelar y Concepción del Uruguay el 15 % de los aislamientos mostraron un color azul (B) y en Nueve de Julio, San Antonio de Areco y Venado Tuerto lo hicieron un 35 % de las cepas. Por último, si analizamos el viraje a pH ácido, en todos los casos obtuvimos unos valores de entre 10 y 35 %, excepto para Concepción del Uruguay, que mostró un 70 %. En forma global, el 42 % de las cepas produjo un pH neutro, el 33 % un pH ácido y el 25 %, alcalino. Con respecto al tipo de crecimiento, observamos que el 25 % de los aislamientos serían de crecimiento lento, el 33% de crecimiento rápido y a un 42% no lo pudimos determinar por este medio (Tabla III.2).

77 III.3.4. Elección de cepas para continuar el estudio.

Los próximos pasos que nos propusimos para nuestro estudio consistieron en: 1. Tratar de develar qué características ambientales podrían explicar el sesgo en

la distribución de los genotipos por sitio de procedencia, y si ello podría tener relación con la baja representatividad de la cepa E109 en el cladograma.

2. Analizar las capacidades simbióticas de las cepas de esta colección con el fin de poner a prueba experimentalmente la hipótesis corriente de que las cepas alóctonas de la población del suelo son buenas competidoras para la nodulación pero mediocres fijadoras de N2, y eventualmente, encontrar

cepas con caracteres deseables para su uso en nuevos inoculantes.

Debido a que resultaba imposible llevar a cabo estos análisis con los 100 aislamientos, decidimos elegir dos representantes de cada sitio de muestreo, de modo tal que también estuvieran representados los otros criterios, es decir: pertenencia a diferentes clados, modo de aislamiento y capacidad de modificar el pH del medio (asimilable a crecimiento rápido o lento). Con este criterio elegimos las siguientes cepas: CA12S, CA61N, CU05N, CU42S, NJ33N, NJ63N, VT12S, VT16S, SA35N, SA37S (para más detalles, ver Tabla 1 en el Apéndice B).