El diálogo molecular: reconocimiento simbiótico.

Si bien el diálogo molecular entre simbionte y hospedante no está diferenciado temporalmente, podemos proponer que éste comienza con la secreción de moléculas fenólicas, llamadas flavonoides, en el exudado radical de la leguminosa (Perret et al. 2000). Estas moléculas van a disparar la activación específica de factores transcripcionales que controlan la expresión de los genes de nodulación en los rizobios, denominados nod, noe y nol. Cada uno de estos genes se hallan ubicados en operón (Perret et al. 2000) y codifican las proteínas que van a catalizar la síntesis de un quito-lipooligosacárido denominado factor Nod, el cual es clave en el desarrollo del nódulo (Mergaert et al. 1997, Fujishige et al. 2008, Streng et al. 2011). Esta molécula es secretada por los rizobios y constituye una señal para la planta, induciendo el inicio de la simbiosis a varios niveles. Entre los procesos que responden a la presencia del factor Nod se encuentran la deformación y enrulado del pelo radical mediante la reorganización de su citoesqueleto, y el inicio de la actividad mitogénica en las células (sub)corticales de la raíz para dar origen al primordio del nódulo (Brencic & Winans 2005). Estas conclusiones fueron obtenidas a partir de estudios realizados con rizobios mutantes incapaces de sintetizar factores Nod, frente a los cuales los pelos radicales no manifiestan reacción alguna (Rélic et al. 1993), y experimentos con plantas inoculadas con factor Nod purificado, las que, en respuesta, desarrollan nódulos en ausencia de rizobios (Truchet et al. 1991). De esta manera, podemos observar que los flavonoides, en conjunto con los factores Nod, constituyen las primeras moléculas-señal intercambiadas por ambos simbiontes. Si bien estas moléculas son las más estudiadas, no son las únicas producidas por ambos simbiontes que participan del evento de intercambio de señales: del lado de la planta podemos mencionar betaínas, ácidos aldónicos, xantonas y jasmonatos, todas ellas también inductores de los genes nod (Kiers et al. 2003, Cooper 2007), mientras que del lado de los (bradi)rizobios podemos mencionar polisacáridos de superficie, proteínas de secreción del tipo I, II y IV, acil-homoserina-lactonas (AHL), hopanoides y ácido indol acético, que actúan como reguladores del crecimiento vegetal (Cooper 2007). Dado que los flavonoides y los factores Nod son las moléculas más estudiadas y caracterizadas, a continuación haremos un breve resumen de sus propiedades más relevantes.

I.3.3.2.1. Flavonoides.

Actualmente se conocen 4.000 tipos de flavonoides distintos, aislados a partir de plantas vasculares, de ellos aproximadamente 30 han sido caracterizados como inductores de genes nod (Brencic & Winans 2005). Todos los flavonoides consisten en dos anillos de benceno unidos por un heterociclo de pirano o piranona. Las sustituciones específicas en los anillos de esa estructura básica dan como resultado calchonas, flavonas, flavononas, flavonoles e isoflavonoides entre otros. En particular, los isoflavonoides producidos por soja, daidzeína y genisteína, son inductores específicos de los genes nod en B. japonicum (Subramanian et al. 2006) e inhiben la expresión de los genes nod en E. meliloti, cuyos genes nod son inducidos por luteolina (Peters 1986). En base a este tipo de observaciones se ha sugerido que cada planta produce una mezcla distinta de estas moléculas, la cual es específica para su simbionte. A su vez la cantidad, aunque siempre del orden nanomolar a micromolar, y el espectro de flavonoides pueden variar con la edad y el estado fisiológico de la leguminosa (Shaw et al. 2006). Curiosamente, este tipo de moléculas también actúan como señales en las respuestas de defensa de la planta frente a patógenos, lo cual está de acuerdo con la idea de que durante su evolución, la simbiosis rizobio-leguminosa habría reclutado sistemas de transducción de

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señales de respuestas a patógenos, y hoy sería una patogénesis atenuada (Perret et al. 2000, Lodeiro et al. 2004, Brencic & Winans 2005).

I.3.2.2.2. Factores Nod.

El primer trabajo sobre el factor Nod se publicó en 1990, en base a la caracterización de dicha molécula en E. meliloti (Maillet et al. 1990). Tan solo seis años después ya se habían caracterizado los factores Nod de al menos 13 especies, lo que permitió poner en evidencia que esta molécula presenta una estructura básica codificada por los genes nodABC, presentes en todos los ejemplos estudiados hasta el momento (Mergaert & Montagu 1997). La estructura básica del factor Nod está constituida por un tetra o pentasacárido de N-acetil-β-D-glucosamina sustituido en el C2 de su extremo no reductor por una cadena de ácido graso insaturado. Además puede contener otros sustituyentes, tanto en su extremo reductor como en su extremo no reductor (Mergaert et al. 1997, Brencic & Winans 2005, Cooper 2007). Diferentes especies sintetizan diferentes tipos de factor Nod, los cuales son distinguibles por el grado de saturación de su cadena de ácido graso y los sustituyentes que presentan en sus extremos (Mergaert & Montagu 1997). B. japonicum produce factores Nod cuya estructura básica puede estar constituida por tetrámeros o pentámeros de N-acetil-β-D-glucosamina, presentando como sustituyentes ácidos grasos 18:1, 16:0 o 16:1 en su extremo no-reductor y O-metilfucosa, fucosa o glicerol en su extremo reductor (Sanjuán et al. 1992). En la Fig. I.6 se muestra el factor Nod sintetizado por B. japonicum USDA 110. De la mano de estos resultados, en un principio se propuso, de forma análoga a lo observado con los flavonoides, que los factores Nod también poseerían especificidad simbiótica (Kondorosi & Schultze 1998). Sin embargo, hasta el momento no se ha podido dilucidar por qué dos especies que nodulan distintos hospedadores expresan un mismo factor Nod. Tal es el caso de R. etli y M. loti, quienes si bien sintetizan un mismo tipo de factor Nod, nodulan distintas especies: P. vulgaris y Lotus japonicus, respectivamente (Perret et al. 2000). De manera adicional, también se ha observado que rizobios pertenecientes al mismo género, capaces de nodular la misma especie, presentan distintas sustituciones en la estructura base del factor Nod (Broughton et al. 2000). En base a estas observaciones, actualmente se ha puesto en duda la idea de que la especificidad simbiótica esté determinada solamente por la estructura del factor Nod.

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La biosíntesis y secreción del factor Nod son procesos complejos, que están codificados en varios genes, conocidos como genes de nodulación. Los genes de nodulación comunes nodABC codifican la biosíntesis y el ensamblaje de las unidades de N- acetil-β-D-glucosamina y la unión de la cadena de ácido graso –presentes en todas las especies de bradirrizobios, mesorrizobios y rizobios– mientras que los genes de nodulación específicos, nol y noe codifican las enzimas que catalizan la “decoración” del factor Nod con diferentes sustituyentes en sus extremos (Masson-Boivin et al. 2009). Además de esos genes, también se han observado genes cuyos productos cumplen funciones activadoras, como nodD, nodVW o syrM, los que detectan a los flavonoides y como respuesta activan la expresión de los otros genes nod. De forma análoga también se han reportado reguladores negativos como nolA, que son antagonistas de los genes activadores en respuesta a señales de percepción del quórum (Wisniewski & Downie, 2002). Se cree que esta última función permite inhibir la expresión de los genes de nodulación una vez que se dispararon las señales de desarrollo del nódulo y que las bacterias se encuentran dentro de la raíz (Loh & Stacey, 2003).

I.3.3.3. La invasión de la raíz.

A partir del trabajo de Fåhraeus (1957) se conocen las etapas de la infección de las raíces de las principales especies de leguminosas, entre las que se encuentra la soja. Fåhraeus observó que los pelos radicales muestran una deformación denominada “enrulado del pelo radical”, que atrapa a las bacterias simbióticas en la curvatura interior. Estas bacterias posteriormente penetran a la raíz formando un canal característico llamado hilo de infección, que se desarrolla longitudinalmente en dirección a las células (sub)corticales de la raíz. El hilo de infección se forma por una invaginación de la pared celular del pelo radical que engloba a las bacterias, las que de esta manera, avanzan permaneciendo siempre en el espacio exterior de la célula vegetal (Gage 2004). En otras especies de leguminosas, las bacterias penetran por hendiduras dejadas por raíces laterales emergentes, en un proceso que se conoce como “crack entry” (Boogerd & Van Rossum 1997). En ambos casos, hilos de infección y crack entry, las bacterias quedan encerradas en vesículas limitadas por la membrana vegetal, las cuales son descargadas en el citoplasma de las células (sub)corticales en división, donde se está formando el nódulo (Gage 2004, Boogerd & Van Rossum 1997).

Posteriormente a los trabajos iniciales de Bhuvaneswari et al. (1980) realizaron mapas de las zonas radicales donde se van formando los nódulos a medida que la raíz crece y se desarrolla, y a partir de esa información, determinaron qué zonas de la raíz son infectables y durante cuánto tiempo. Así, distinguieron tres zonas de la raíz, diferentes en cuanto a su arquitectura y a su crecimiento (Fig. I.7): la primera de ellas, a continuación del hipocótile, es la zona de pelos maduros, la siguiente es la zona de pelos radicales en desarrollo y la tercera, llegando al ápice, es la denominada zona apical, donde se encuentran los pelos radicales emergentes (Bhuvaneswari et al. 1980, Gage 2004). En tal sentido, Bhuvaneswari et al. (1980) observaron que los pelos radicales maduros (la primera zona) no pueden ser infectados, induciendo la idea que para que haya enrulado es necesario que los pelos radicales se encuentren en pleno crecimiento polar, ya que el enrulado ocurre por un crecimiento desigual de las paredes celulares longitudinales del pelo. Además propusieron que la infección de una zona particular de la raíz de soja debe ocurrir dentro de las seis horas de la inoculación, ya que luego de ese tiempo, los pelos radicales de esa zona maduraron y ya no son más infectables (Bhuvaneswari et al. 1980). (Figs. I.7 y I.8)

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Como señalamos más arriba, las deformaciones de los pelos radicales son inducidas por el factor Nod. Esto tiene lugar en periodos de tiempo mucho más cortos: se demostró que luego de tres a seis minutos de adicionar factor Nod purificado sobre la zona de pelos emergentes en las raíces ocurren cambios en el citoesqueleto de los pelos radicales asociados con una depolimerización de los filamentos de actina (Allen 1996, Cárdenas 1998). Sin embargo, trabajos más recientes proponen que la deformación del pelo radical requiere del receptor del factor Nod (Amoret 2003, Radutoiu 2003) pero no de la vía de transducción de señales que éste estimula (Esseling 2003, Miwa 2006).

Una vez enrulado el pelo radical e iniciado el hilo de infección, en general una sola célula bacteriana penetra y da origen a una progenie clonal que es la que completa el avance e invade el nódulo en formación. De este modo, a menudo cada nódulo contiene un único

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clon de bacterias. Sin embargo, en ocasiones más de una bacteria es atrapada durante el enrulado, y si poseen distintos genotipos, es posible observar que dos bacterias diferentes van a formar parte del hilo de infección (Gage 2004). En estos casos, menos frecuentes, un único nódulo puede estar ocupado por más de un clon (es extremadamente raro que haya más de dos), lo que suele ser referido como “doble ocupación” de un nódulo.

Ya que el crecimiento del hilo de infección es ante todo una invasión de los tejidos de la planta por parte de un microorganismo, la planta naturalmente dispara respuestas de defensa similares a las que utiliza frente a la invasión de un microorganismo patógeno (Frayssé et al. 2003). Sin embargo, en el caso de la simbiosis, la planta debe atenuar estas respuestas, permitiendo que ingresen las bacterias simbióticas en división y que no sean tratadas como parásitos. Para ello, los polisacáridos superficiales parecerían tener un rol crucial (Fraysse et al. 2003). En correspondencia con ello se observó que mutantes delecionales del gen exoB en B. japonicum, afectados en la producción del exopolisacárido (EPS), son incapaces de invadir e infectar raíces de soja y solo forman nódulos vacíos (desprovistos de bacterias o bacteroides) (Quelas et al. 2010). Por su parte, E. meliloti, que expresa dos tipos de EPS: el succinoglicano o EPSI y el galactoglucano o EPSII, necesita solo uno de ellos para producir una infección normal, pese a las diferencias estructurales entre ambos, pero puede prescindir de los dos si posee intactos el polisacárido capsular (KdoPS) y el lipopolisacárido (LPS) (Hozbor et al. 2004, Jones et al. 2007).

Las lectinas de la planta, ya mencionadas por su rol en la adhesión, también juegan un papel en la infección, aunque el mismo no ha sido aclarado. Estas conclusiones se basan en trabajos que han demostrado que plantas de trébol expresando la lectina de arveja pueden ser noduladas por R. leguminosarum bv. viceae (Díaz. 1989), en tanto que plantas de L. japonicus llevando la lectina de soja son noduladas por B. japonicum (van Rhijn et al. 1998). Sorprendentemente, en ambos casos cada especie de bacteria produjo su propio factor Nod, lo que indica que la presencia de la lectina heteróloga de alguna manera relajó la exigencia de la planta hospedadora para el reconocimiento simbiótico mediante el sistema de transducción de señales que desencadena el factor Nod. Dado que el EPS parece ser el receptor de las lectinas vegetales, se ha observado que no hay desarrollo del hilo de infección cuando plantas transgénicas de L. japonicus son inoculadas con B. japonicum alterados en la síntesis del EPS (van Rhijn et al. P 1998). En ese caso, los autores proponen que el reconocimiento del EPS mediado por la lectina estaría vinculado a la entrada de los rizobios a la raíz vía el hilo de infección. Por lo tanto, es probable que la lectina vegetal actúe como socia del EPS en la atenuación de la respuesta de defensa (Pérez-Giménez et al. 2012).

El sistema de defensa de la planta también estaría involucrado en la regulación de la cantidad de nódulos que puede formar la leguminosa. Se cree que la respuesta al factor Nod es antagonizada por hormonas de la planta como etileno o ácido jasmónico (Sun et al. 2006), los cuales, aplicados en exceso, promueven que se aborten los hilos de infección (Vasse 1993). Además de estos sistemas de defensa de la planta, se ha propuesto que existen otros que permiten la regulación del número de nódulos que pueden formarse. Esta respuesta se conoce como autorregulación de la nodulación y está regulada por un ciclo donde intervienen kinasas y fosfatasas que perciben una señal producida por la raíz y que a su vez induce la producción de un inhibidor en la parte aérea. Este inhibidor se traslada a las raíces e impide nueva nodulación cuando el número de nódulos en funcionamiento allí ya es suficiente como para satisfacer las necesidades de asimilación de N en la parte aérea

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(Reid et al. 2011). Como mencionamos al principio, la nodulación solo ocurre cuando la leguminosa crece en un suelo deficiente en N. Si a una planta que ya comenzó con su proceso de nodulación se le adiciona una fuente alternativa de N, en particular NO3

–_{, ésta}

inhibe la continuidad del proceso de nodulación. Luego, una vez desarrollados los nódulos, el agregado de una fuente alternativa de N inhibe la fijación de N2. Estas reacciones,

sumadas a la reciente observación de que plantas crecidas en NO3

– _{restringen la adhesión}

(Perez-Gimenez et al. 2013), indican que la inhibición de la simbiosis por la presencia de fuentes alternativas de N ocurre a varios niveles yuxtapuestos. Esto es razonable, ya que para una planta que dispone de fuentes alternativas de N en abundancia, la presencia de los (bradi)rizobios dentro de sus tejidos radicales se asemeja más a un parasitismo que a un mutualismo. Sin embargo, aún falta aclarar mejor cómo se regulan e interconectan estos procesos, y cuál es su relación con los sistemas de defensa de la planta.