Morfología microscópica.

Para caracterizar la morfología celular se tomaron muestras del centro y de los bordes de cada colonia de swarming,obtenidas en cada una de las fuentes de carbono y las observamos en el MET con el protocolo de fijación antes mencionado. Tal como habíamos observado en el fenotipo macroscópico de LP 3008, su mayor desplazamiento también se relacionaba con el fenotipo microscópico, presentando un mayor número de flagelos con respecto a LP 3004. En particular, en las células tomadas del borde de las colonias obtenidas con L-arabinosa observamos claramente, tanto en LP 3004 como en LP 3008, la presencia de ambos flagelos (Fig. V.5.B). La morfología de los flagelos perítricos presentaba una forma sinusoidal, en cambio el flagelo subpolar presentaba una forma más relajada (Fig. V.5.B) de acuerdo con observaciones previas (Althabegoiti et al. 2008). En el caso de LP 3008, los flagelos perítricos fueron observados de forma más abundante en todos los casos. En cambio, en LP 3004 los flagelos perítricos no pudieron ser observados en manitol o extracto de levadura, lo cual nos sorprendió, dado que como se mencionó anteriormente, en otras especies el flagelo lateral está presente cuando las bacterias realizan

swarming y podría ser inducido por el contacto con la superficie de mayor viscosidad. Sin embargo, se ha observado que en Rhodospirillum es necesaria la presencia del flagelo polar para desplazarse (McClain et al. 2002).

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Por último, volvimos a corroborar que las células tomadas desde los bordes de la colonia presentaban una morfología distinta a las células tomadas del centro independientemente de la fuente de C, y además observamos nuevamente el tipo de asociación de las células por los polos en las placas con manitol o gluconato como única fuente de C.

V.5. Resumen y discusión.

Al comenzar este capítulo, hemos comentado sobre la importancia de la movilidad en la competición para la nodulación. De entre los tipos de movilidad identificados en bacterias (Henrischen, 1972) el swarming podría jugar un papel en el desplazamiento de los (bradi)rizobios sobre las superficies del suelo o la planta y por lo tanto, podría estar implicado en la dispersión de los (bradi)rizobios en el suelo, la cual es determinante de su competitividad para nodular (López García et al. 2002). Además, B. japonicum, a diferencia de otros (bradi)rizobios, expresa dos sistemas flagelares diferentes, uno subpolar y otro lateral. Se ha sugerido en otras bacterias que el sistema lateral podría ser el responsable del

swarming, lo cual nos indicó que este tipo de movimiento muy probablemente fuera llevado a cabo por B. japonicum. Por ello, decidimos estudiar la capacidad de B. japonicum LP 3004 y LP 3008 (derivadas de USDA 110) para realizar dicho desplazamiento. Como no contábamos con un protocolo para poner en evidencia al swarming, nuestro primer objetivo incluía encontrar las condiciones adecuadas en las cuales B. japonicum podría realizarlo. Luego de un número de intentos negativos, en los cuales fuimos probando diversas variables, encontramos un protocolo que nos permitió observar el swarming de forma reproducible en cepas derivadas de USDA 110. Este protocolo se basó en la utilización de un gradiente de la fuente de C en las placas de Petri. El gradiente implicaría un déficit nutricional para la bacteria, y al mismo tiempo podría ser representativo de cambios dinámicos de las concentraciones que ocurren en el suelo y en la rizósfera.

Como segundo objetivo nos planteamos confirmar que el fenotipo macroscópico observado en las placas de Petri con gradiente en la fuente de C se correlacionaba con el fenotipo microscópico esperado para las células que realizan swarming. Para realizar la observación microscópica, nuevamente nos enfrentamos al desafío de poner a punto un protocolo para fijar y teñir las células para su posterior visualización en el MET. En nuestro caso, realizamos una adaptación del método propuesto por Kirov et al. (2002), en el cual las células son fijadas directamente desde la colonia de swarming, evitando así el desprendimiento de flagelos y la modificación de las estructuras de asociación entre bacterias. Con este protocolo logramos observar y caracterizar microscópicamente las células de B. japonicum que realizaban swarming. Las células de los bordes presentaban una morfología diferencial con respecto a las células del centro o a las células que provenían de colonias en crecimiento en placas sin gradiente. En particular, y en concordancia con lo descripto para otras bacterias que realizan swarming, las células de los bordes presentaban mayor superficie de contacto y mostraban hiperflagelación. Sin embargo, estas células estaban asociadas por los polos. Este hecho, si bien no está descripto para otras bacterias que realizan swarming, tampoco contradice la definición general del movimiento que mencionamos más arriba.

Cuando evaluamos si existía algún tipo de relación entre las fuentes de C y el desarrollo del swarming, observamos que las células de los bordes se encontraban híperflageladas, pero que LP 3008 siempre presentó un mayor número de flagelos perítricos, independientemente de la fuente de C utilizada. En cambio, en la cepa LP 3004

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el flagelo perítrico no pudo ser observado en las placas de swarming que contenían manitol o extracto de levadura como fuente de C. Este resultado se correspondía con el perfil de flagelinas observado en medios líquidos (Althabegoiti et al. 2011). Sin embargo a nivel del fenotipo macroscópico, observamos que de manera análoga a lo observado para el movimiento de natación, LP 3008 siempre mostró un perfil de desplazamiento mayor que LP 3004, independientemente de las fuentes de C. Al inquirir si existía alguna diferencia del

swarming con las distintas fuentes de C, observamos que con gluconato o L-arabinosa se necesitaba un menor número de duplicaciones. Estos valores eran similares a los observados en colonias de swarming de E. meliloti (Nogales et al. 2010). En algunos casos, observamos que los centros de las colonias de swarming presentaban un color más oscuro con respecto a los bordes, que eran blancos y traslúcidos. Esto nos indicaría que las células del centro de la colonia presentaban una diferenciación fisiológica con respecto a las del borde. Se ha demostrado que para realizar el swarming es necesario que las bacterias secreten sustancias surfactantes, una de las cuales son las acil-HSL (Daniels et al. 2004, 2006, Kearns 2011). Aunque bien es conocido que B. japonicum USDA 110 no sintetiza en cantidades significativas de acil-HSL (Pongsilp et al. 2005), se ha demostrado que en bacterias como

E. coli o S. enterica los lipopolisacáridos (LPS) superficiales estarían cumpliendo dicha función (Kearns 2011). Por lo tanto no sería raro que en B. japonicum las células de los bordes de la colonia de swarming estuvieran sintetizando una mayor cantidad de LPS a fin de disminuir la tensión superficial y favorecer la translocación. Esta suposición podría ponerse a prueba con mutantes específicos en la biosíntesis de polisacáridos superficiales.

Hasta aquí, si bien habíamos logrado caracterizar el swarming en LP 3004 y LP 3008 en diversas fuentes de carbono tanto a nivel macroscópico como microscópico, no habíamos podido determinar si la condición en la cual B. japonicum realizaba swarming era debido al déficit nutricional o solo al gradiente nutricional. Si extrapoláramos nuestros resultados a las condiciones naturales a las cuales deberían estar expuestas las bacterias, resulta razonable que las mismas necesiten un gradiente de nutrientes, ya que es esperable que en la rizósfera la concentración de los nutrientes no sea estática. Sin embargo, las células no se desplazaron en las placas de Petri de forma direccionada hacia las zonas de mayor concentración de nutrientes, lo cual resulta curioso dado que las bacterias presentan un sistema de quimiotaxis que les permite censar la diferencia de concentración de los nutrientes y en base a ello orientar su desplazamiento. Por análisis bioinformático de la secuencia nucleotídica de B. japonicum USDA 110 (Kaneko et al. 2002), hemos hallado dos sistemas quimiotácticos, lo cual nos haría pensar que cada uno de ellos podría estar relacionado con cada uno de los flagelos. Sin embargo, en E. coli se ha propuesto que el sistema quimiotáctico pero no la quimiotaxis en sí es necesario para que esta bacteria realice swarming (Burkart et al. 1998), si bien no se ha aclarado del todo cuál es la función del sistema quimiotáctico en este contexto. Además, se ha reportado que durante el swarming las bacterias no pueden modificar la dirección de sus movimientos por medios de tumbos, tal como ocurre en respuesta al sistema de quimiotaxis en medios líquidos (Kearns 2011). En base a esto podríamos hipotetizar que el posible requerimiento del gradiente nutricional para que B. japonicum realice swarming podría relacionarse con un rol del sistema quimiotáctico en percibir dicho gradiente, lo cual podría ser parte del disparo de la señalización intracelular que va dar como resultado la hiperflagelación y la activación del movimiento.

CAPITULO

VI