Cdc11 y Shs1/Sep7

Mediante análisis filogenéticos se ha comprobado que Cdc11 y Shs1 comparten un mayor de grado de similitud que cualquier otro par de septinas, por lo que pertenecen al mismo grupo filogenético, habiendo divergido de un antecesor común (Pan et al., 2007)(Fig. 10A). Esta duplicación se ha mantenido en algunos grupos de hongos, porque a pesar de ocupar la misma posición terminal en el octámero han divergido en su función. Se ha propuesto que la presencia de varias subunidades relacionadas proporciona plasticidad fisiológica, ya que la incorporación de subunidades alternativas supone un mecanismo para lograr la diversidad ultraestructural al aportar nuevas formas de interacción

entre subunidades o con diferentes conjuntos de proteínas asociadas (Garcia et al., 2011). Shs1 es a menudo considerada como una septina accesoria porque los mutantes nulos (shs1∆) tienen un fenotipo leve (Mino et al., 1998; Iwase et al., 2007; Garcia et al., 2011) y debido a que es recuperada en cantidades subestequiométricas en complejos nativos de septinas bajo determinadas condiciones (Mortensen et al., 2002). Sin embargo, Shs1 es la septina mitótica más fuertemente modificada por fosforilación y SUMOilación (Johnson y Blobel, 1999; Smolka et al., 2006; Egelhofer et al., 2008) y esto está correlacionado con el comportamiento dinámico de los filamentos de septinas en el cuello (Dobbelaere et al., 2003), por lo que se empieza a considerar a Shs1 como una subunidad reguladora del anillo de septinas. Aunque esta septina no sea esencial para la viabilidad, los octámeros con Shs1 deben generar in vivo filamentos con características especiales o con la habilidad de reclutar proteínas únicas que regulen de forma fina la morfogénesis celular (Iwase et al., 2007).

En contraste con la pérdida de Shs1, las células cdc11∆ son, dependiendo del fondo genético, inviables (Versele et al., 2004) o exhiben un crecimiento extremadamente lento y una morfología alargada (Frazier et al., 1998). Sin embargo, en los fondos donde las células cdc11∆ mueren, el doble mutante cdc11∆ sep7∆ es viable y sobrevive, debido a polimerización de los octámeros a través de la interacción no natural Cdc12-Cdc12 (McMurray et al., 2011). Por el contrario, en los fondos genéticos donde cdc11∆ es viable, la sobreexpresión de Shs1 produce letalidad, lo que no sucede con células CDC11 (Iwase et al., 2007). Esto indica que los hetero-octámeros de Shs1 no son suficientes para la viabilidad, y cuando Cdc11 no está presente, Shs1 se une a Cdc12 y previene la polimerización de los hexámeros Cdc12-Cdc3-Cdc10- Cdc10-Cdc3-Cdc12.

Las dos zonas más divergentes entre Cdc11 y Shs1 son el extremo N-terminal y la extensión C-terminal que contiene el coiled-coil, que es mayor en el caso de Shs1 (Fig. 8A), por lo que se supone que son las regiones que deberían determinar sus propiedades diferenciales. En cuanto a sus extremos C-terminales (CTEs), se ha descrito que no son esenciales ni en Cdc11

Figura 10. (A). Filogenia de las septinas. Dendrograma que muestra las relaciones evolutivas de las septinas de S. cerevisiae (Sc), A. gossypii (Ag), C. albicans (Ca) y humanos (Hs) construido por alineamiento múltiple con Clustal Omega. Los grupos están basados en la clasificación descrita por Pan y colaboradores (2007). (B). Papel de los CTEs en la organización de los filamentos de septinas. Los CTEs de dos monómeros de Cdc3 y dos monómeros de Cdc12 adyacentes se asocian formando un haz de cuatro hélices (four-helix bundle, 1) que es esencial para posicionar los octámeros enfrentados y formar filamentos pareados. Los CTEs de Cdc11 y Shs1 están implicados en la interacción con otras proteínas que se localizan en el cuello. Modificado de Finnigan et al., 2015b.

ni en Shs1 para la formación de hetero-octámeros o filamentos in vitro (Bertin et al., 2008; Garcia et al., 2011; Booth et al., 2015) ni para el ensamblaje de la estructura de septinas en el cuello in vivo (Versele

et al., 2004; Finnigan et al., 2015b). Sin embargo, la eliminación de ambos CTEs simultáneamente o

la mutación de los coiled-coils causa severos fenotipos en el crecimiento y una morfología elongada, indicativo de un fallo en citoquinesis emparejado a la función de las septinas (McMurray et al., 2011; Finnigan et al., 2015b). Aunque los CTEs puedan contribuir a la organización supramolecular y/o la dinámica de las estructuras de septinas en el cuello, su función principal en Cdc11 y Shs1 es el reclutamiento de otras proteínas a través de la interacción con sus coiled-coils (Finnigan et al., 2015a). Los elementos coiled-coil de los CTEs de Shs1 y Cdc11 pueden tener múltiples papeles, tales como ayudar en la polimerización de filamentos, en la organización 3D de las estructuras de septinas y/o conducir cambios conformacionales que dirijan transiciones geométricas en la arquitectura supramolecular de la estructura de las septinas. Así, también puede servir para el reclutamiento al cuello de factores necesarios para otros procesos celulares. De hecho, se ha demostrado que existe interacción física o genética de Shs1 (y/o Cdc11) con otras proteínas del cuello tales como componentes del polarisoma Spa2 (Mino et al., 1998), las proteín kinasas Elm1 (Bouquin et al., 2000), Gin4 (Okuzaki et al., 1997; Mortensen et al., 2002), Hsl1 (Shulewitz et al., 1999) y Kcc4 (Barral et al., 1999), la formina Bnr1 (Gao

et al., 2010), la proteína de asociación al ER Scs2 (Chao et al., 2014), la proteína F-BAR Hof1 (Meitinger et al., 2011), la IQGAP Iqg1 (Iwase et al., 2007), y las proteínas Nis1 (Iwase y Toh-e, 2001) y Bni5 (factor

de unión a Myo1)(Lee et al., 2002; Finnigan et al., 2015a). Esta función de los CTEs de Cdc11 y Shs1 en el reclutamiento de otras proteínas que desempeñan su función en el anillo es completamente distinta de la que se ha atribuido a los CTEs de Cdc3 y Cdc12 (Fig. 10B). Estos últimos son esenciales para el ensamblaje de los filamentos de las septinas, ya que los de dos subunidades adyacentes del octámero se asocian formando un coiled-coil paralelo. A su vez, esta estructura se combina con otra similar correspondiente a un filamento adyacente para formar un haz de cuatro hélices (four-helix bundle) que posiciona a los hetero-octámeros paralelos en registro y constituye la base para la formación de filamentos pareados (Versele et al., 2004; Bertin et al., 2008; Bertin et al., 2010).

Mediante mutagénesis dirigida de los residuos básicos o deleción de la hélice α0 se ha comprobado que esta hélice no es esencial en la interacción Cdc11-Cdc11 o Shs1-Cdc11, aunque su eliminación desestabiliza ligeramente ambas proteínas (Booth et al., 2015; Finnigan et al., 2015b). Sin embargo, los residuos básicos de la hélice α0 de Cdc11 y Sep7 son esenciales para concentrar los complejos de septinas en la membrana plasmática, incrementando la incorporación en polímeros (McMurray et al., 2011; Finnigan et al., 2015b), y esta función es compartida también por Cdc10 (Bertin et al., 2010).

En referencia a la estequiometría de los filamentos, se sabe que los complejos de Shs1 y Cdc11 tienen la misma longitud, cuando son coexpresadas con distintas combinaciones de septinas en bacterias. La mayoría de los complejos de Cdc11 son hetero-octámeros, mientras que los complejos de Shs1 también tienen una proporción significativa de hexámeros y heptámeros, sugiriendo que Shs1 tiene menos afinidad que Cdc11 para unirse a Cdc12. Además, los mutantes shs1-∆CTE forman más octámeros que los complejos de Shs1, lo que sugiere que el CTE puede desestabilizar la unión Shs1- Cdc12 a través de la interfaz G (Garcia et al., 2011). Estos estudios también concluyeron que hay 3 niveles de fosforilación que podrían regular el ensamblaje de septinas, 1) la fosforilación en el CTE de Shs1 que evitaría la formación de filamentos, 2) la fosforilación en una interfaz específica podría debilitar la interacción septina-septina y con ello potenciar el desmontaje del complejo y/o la disociación de una

subunidad individual y su sustitución por otra subunidad alternativa y 3) la fosforilación podría inducir cambios estructurales que impulsen nuevas interacciones cruzadas y con ello la adquisición de una ultraestructura marcadamente diferente (Garcia et al., 2011).