CAPÍTULO I: La dosis génica de las septinas juega un papel fundamental en la inhibición de la separación celular
1.2 sep7∆∆, a diferencia de otros mutantes nulos de septinas (cdc11∆∆ y cdc10∆∆), presenta
Ya se conocía en S. cerevisiae que las septinas cooperaban en la formación del septo, las proyecciones de conjugación y las esporas, cuando Warenda y Konopka (2002) estudiaron sus homólogos en
C. albicans. Estos autores comprobaron que, al igual que en S. cerevisiae, CDC3 y CDC12 son esenciales
para la viabilidad. En contraste, los mutantes cdc10∆∆ y cdc11∆∆ son viables pero tienen defectos en citoquinesis, localización de la quitina en la pared celular y morfología de la yema (Fig. 18A). Así, la
mayoría de las células cdc10∆∆ tienen una apariencia silvestre a 30°C, pero a 37°C el 34% de sus células son elongadas y muchas de ellas muestran un patrón muy similar a las pseudohifas. A 42°C, el 94% de las células cdc10∆∆ son elongadas y forman grupos que no se separan. Por otro lado, el mutante
cdc11∆∆ exhibe un fenotipo independiente de la temperatura, con colonias arrugadas y asimétricas
durante su crecimiento en placa, y un 91% de células anormales en medio líquido. A diferencia de las células cdc10∆∆, el mutante cdc11∆∆ no muestra yemas elongadas a 42°C. Sin embargo, cdc10∆∆ y cdc11∆∆ tienen en común que forman células encadenadas con múltiples núcleos, lo que indica defectos en citoquinesis. Por su parte, la deleción de SEP7 causa defectos leves en citoquinesis durante el crecimiento levaduriforme (Warenda y Konopka, 2002). En cuanto al crecimiento filamentoso, los mutantes cdc10∆∆ y cdc11∆∆ responden a estímulos de inducción hifal y forman hifas, pero presentan una curvatura anormal y un crecimiento más lento que una cepa silvestre. Además, los mutantes
cdc11∆∆ son defectivos en el crecimiento invasivo en medio sólido. En cuanto a Sep7, los mutantes
de esta septina son capaces de formar hifas indistinguibles de las de un silvestre, con respecto a su tamaño y morfología (Warenda y Konopka, 2002).
No obstante, estudios más recientes demostraron que la pérdida de Sep7 resulta en la separación celular de las hifas, ya que a tiempos largos de filamentación comienzan a degradarse los septos más antiguos (los más cercanos al cuerpo celular) y se observan cuerpos celulares aislados y fragmentos de hifas sin cuerpo celular (González-Novo et al., 2008)(Fig. 18B). Para cuantificar este defecto, se construyó la cepa sep7ΔΔ reemplazando la región codificante completa del gen en cada uno de los alelos por las secuencias de los genes HIS1 y SAT1 (que confiere resistencia a ClonNat) en la cepa BWP17 (todas las cepas construidas durante este trabajo fueron comprobadas por PCR y/o secuenciación). Posteriormente, se fijaron muestras de hifas silvestres y mutantes sep7ΔΔ tras 2,5; 3,5 y 4,5 h de inducción de la filamentación y se determinó el porcentaje de hifas en las que se había activado la separación contando el número de cuerpos celulares aislados frente a los que todavía se mantenían unidos a la hifa (salvo que se indique lo contrario, el resto de experimentos de esta Memoria se realizaron en las mismas condiciones). Los resultados mostraron que tras 2,5 h de filamentación el mutante sep7∆∆ presentaba un 15% de separación, a diferencia de la cepa silvestre que apenas tenía cuerpos separados (Fig. 18B). Esta diferencia se mantuvo en el siguiente punto (3,5 h de filamentación), debido a que el porcentaje de hifas separadas aumentaba desde el 10% observado en el silvestre a cerca del 30% en el mutante sep7ΔΔ. A 4,5 h de filamentación, tanto la cepa silvestre como el mutante
sep7∆∆ presentaban un alto porcentaje de cuerpos separados (en torno al 35% en un silvestre y a un
45% en el mutante). Dado que a 2,5 h de filamentación una cepa silvestre prácticamente permanece intacta y a 4,5 h los porcentajes de separación son más parecidos se determinó tomar un tiempo intermedio (3,5 h de filamentación) para posteriores contajes de separación celular.
Figura 18. Los mutantes de septinas alteran la morfología celular. (A). Los mutantes nulos de las septinas Cdc10 y Cdc11 presentan una morfología elongada. Las cepas de C. albicans analizadas incluyen BWP17 (A-C) y los mutantes cdc10∆∆ (D-F) y cdc11∆∆ (J-L). Además las cepas cdc10∆∆ y cdc11∆∆ con una copia del gen silvestre integrado bajo su promotor endógeno (G–I y M–O) fueron analizadas para confirmar que el fenotipo era debido a la deleción del gen indicado. Barra de escala, 10 μm. Tomada de Warenda y Konopka (2002). (B). Los mutantes sep7Δ∆ forman filamentos que se separan después de citoquinesis. Izquierda: Imágenes de hifas silvestres y sep7Δ∆ tras 3 h en condiciones de filamentación. Las regiones indicadas con números están ampliadas en los paneles inferiores. Barra de escala, 5 μm. Tomada de González-Novo et al., (2008) Derecha: Cuantificación del número de cuerpos celulares separados a las 2,5; 3,5 y 4,5 h de filamentación. El gráfico muestra el porcentaje promedio en la cepa silvestre (negro) y en el mutante sep7Δ∆ (rojo) (4 experimentos, n>200 células), con la desviación estándar. (C). Las septinas se unen formando octámeros no polares. Representación esquemática de los octámeros de una cepa silvestre y los mutantes sep7Δ∆, cdc11Δ∆ y cdc10Δ∆. (D). No todos los mutantes de septinas presentan separación celular de las hifas. El gráfico muestra el porcentaje promedio de cuerpos separados en la cepa silvestre (negro) y en los mutantes sep7Δ∆, cdc11Δ∆ y cdc10Δ∆ (blanco), con la SEM, a 3,5 h de filamentación. Los asteriscos indican el nivel de significación (****: p< 0,0001; t test). WT (OL1417), sep7Δ∆ (OL2138), cdc11Δ∆ (OL1365) y cdc10Δ∆ (OL2213).
A continuación, para estudiar si este defecto era específico de mutantes sep7ΔΔ o el resto de las septinas también estaban implicadas en la regulación de la separación en hifas, se construyeron los mutantes nulos en el resto de las septinas viables, cdc11∆∆ y cdc10∆∆ (Fig. 18C). En estos mutantes de deleción, al igual que en el mutante sep7∆∆, la región codificante completa del gen en cada uno de los alelos se sustituyó por los genes HIS1 y SAT1 en la cepa BWP17. Una vez construidas, se estudió cómo afectaba la pérdida de cada gen a la separación de las hifas y se comprobó que presentaban un porcentaje similar a la cepa silvestre (5-10%) a 3,5 h de filamentación, a diferencia del mutante
sep7∆∆ cuyo porcentaje de separación celular era superior y la diferencia con respecto al silvestre
era estadísticamente significativa (Fig. 18D). Sin embargo, es difícil comparar las condiciones de filamentación del silvestre y de los mutantes cdc11∆∆ y cdc10∆∆, pues en estos últimos el desarrollo hifal está retrasado en comparación con el silvestre, presentando unas hifas abombadas que pierden ligeramente la secreción polarizada y filamentos curvos que crecen más lentamente. Por tanto, estos resultados indican que Sep7 tiene una función específica en la regulación de la separación celular de hifas que no es compartida por Cdc10 o Cdc11.