Construcción de cepas

La deleción de genes de C. albicans así como los truncamientos y el marcaje con proteínas fluorescentes y epítopos se realizaron con el método mediado por PCR usando los módulos pFA (Gola

et al., 2003; Schaub et al., 2006; Reijnst et al., 2011). Los transformantes se seleccionaron en medio

YNB suplementado con los aminoácidos necesarios según sus auxotrofías, o en YEPD con clonNAT a una concentración final de 200 μg/ml (Werner BioAgents) para seleccionar cepas SAT1. Las cepas que contenían proteínas marcadas con proteínas fluorescentes o epítopos se consideraban funcionales en tanto que se observase un crecimiento normal en un fondo heterocigoto. Todas las cepas se confirmaron por PCR usando oligonucleótidos obtenidos de la casa comercial Biomers o Sigma-Aldrich y/o por secuenciación.

• Mutantes de deleción. La construcción de cepas carentes de un gen determinado se llevó a cabo

usando la técnica de reemplazamiento genético (Rothstein, 1991), la cual se basa en la transformación integrativa de las moléculas lineales de DNA. Esta estrategia consiste en el uso de un casete de transformación obtenido mediante PCR (a partir de DNA plasmídico de alguno de los módulos pFA), el

cual contiene un marcador de selección flanqueado por las regiones no codificantes 5’ y 3’ del gen para dirigir la integración, regiones que provenían de oligonucleótidos de 100 pb. Estas regiones homólogas permiten la recombinación del fragmento con uno de los alelos del gen a delecionar, sustituyendo el ORF del mismo por el marcador de selección.

• int1-∆N. Se amplificó la región 5´ de INT1 a partir de DNA genómico de Candida y se

clonó en pFA-ARG4 mediante los sitios PvuII-BglII (pFA-5’INT1-ARG4). La ligación de los distintos fragmentos en los plásmidos pFA se llevó a cabo usando el kit de ligación Rapid DNA Dephos &

Ligation Kit (Roche) (este procoloco se seguirá siempre que se requiera ligación en las construcciones

posteriores). Después se amplificó la zona del promotor de INT1 mediante PCRs independientes que luego se unificaron mediante PCR de fusión y se clonó en pFA-5’INT1-ARG4 usando PmeI-SalI/

SpeI (pFA-5’INT1-ARG4-PINT1). Posteriormente, se amplificó parte de la región codificante de INT1

(G1127-Q1711) y se clonó en el plásmido anterior a través de los extremos SalI-SpeI. El plásmido resultante se denominó pFA-5´INT1-ARG4-PINT1-INT1 ORF (G1127-Q1711), cuyo número de la colección es pC1165. La construcción de este plásmido se representa en la Figura 72. Finalmente, se

amplificó el inserto de pC1165 y se transformó Candida (en un fondo INT1/int1∆) para conseguir la versión INT1-∆N-HA. Para posteriores ensayos, se marcó esa construcción con GFP amplificando el DNA

de pFA-GFP-HIS1 usando oligonucleótidos que recombinaran justo después del truncamiento. Así se obtuvo la versión INT1-∆N-GFP.

• int1-∆C. Se amplificó un casete por PCR partiendo del DNA de pFA-GFP-HIS1 usando

oligonucleótidos que recombinaran entre las posiciones 1134 y el final de la región codificante de INT1 y se transformó Candida. Así se obtuvo la versión INT1-∆C-GFP. Para la versión INT1-∆C-HA se siguieron los mismos pasos anteriores amplificando el DNA del plásmido pFA-HA-URA3.

• Truncamientos de SEP7. Se amplificaron varios casetes por PCR partiendo del DNA de los

pFA-yEmCherry-HIS1/URA3 usando oligonucleótidos que recombinaran en las posiciones 394, 522, 580 o 629 y en el extremo 3´ no codificante de SEP7 y se transformó Candida.

• Quimeras CDC11-SEP7. Se amplificó el extremo C-terminal de Sep7 desde Glu580 (para

CDC11CTEl-Sep7_{) o desde Arg354 (para CDC11}CTEc-Sep7_{) usando como molde DNA genómico de BWP17. Se}

clonó en vectores pFA-ARG4 usando PvuII-BamHI (se generaron los plásmidos pFA-Sep7E580-ARG4 y pFA-Sep7R354-ARG4, pC1292 y pC1294 respectivamente). A continuación, se amplificaron los casetes a partir de los plásmidos anteriores con los oligonucleótidos correspondientes para que recombinaran en CDC11 en la posición 303 (CDC11CTEl-Sep7_{) o 380 (CDC11}CTEc-Sep7_{) y se transformó la cepa sep7∆∆.}

4.1 Mutagénesis dirigida.

• Cepa sep7-10A. La mutagénesis dirigida de los sitios de fosforilación de Sep7 se realizó a

partir del DNA del plásmido pFA-Sep7R354-ARG4 (pC1294, que contenía la secuencia de Sep7 desde R354) usando dos oligonucleótidos que contenían cinco mutaciones a Alanina cada uno y usando el kit Quik Change Lightning Multi Site (Agilent Technologies). Al plásmido resultante se le denominó pFA-Sep7-10A-ARG4 (pC1346). Una vez generadas las mutaciones y confirmadas por secuenciación, se creó un fragmento de sep7-10A fusionado a Cherry (amplificando por un lado el fragmento de SEP7 con las mutaciones a partir de pFA-Sep7-10A-ARG4 y por el otro la secuencia codificante para la proteína Cherry a partir de pFA-yEm-Cherry-URA3, pC1256); finalmente ambos fragmentos se fusionaron por

PCR recombinante. Dicho fragmento se clonó en los plásmidos pFA-ARG4/HIS1 usando los sitios

SalI-BamHI (pFA-SEP710A-Cherry-ARG4/HIS1, pC1352/pC1353). Finalmente, para transformar Candida,

se amplificó el casete desde pFA-Sep710A-Cherry-ARG4/HIS1 que contenía las mutaciones en SEP7, la secuencia de la Cherry y un marcador auxotrófico. Para esta amplificación se usaron oligonucleótidos que recombinaban en la zona deseada (entre Arg354 y el final de la secuencia codificante de SEP7).

• Cepas sep7-2A y sep7-2E. En primer lugar se clonó la región 5’ del gen de SEP7 en vectores

pFA-ARG4/HIS1. Para ello se amplificó dicha región por PCR a partir de DNA genómico y se clonó en los plásmidos cortando con SalI y BamHI (pFA-5´SEP7-ARG4/HIS1, pC1331/pC1333). Posteriormente se clonó en esos mismos vectores el extremo N-terminal de SEP7 con promotor (desde-689 hasta +128), amplificando dicha región por PCR a partir de DNA genómico. Los oligonucleótidos para esta PCR introducían las mutaciones S14A-S22A y S14E-S22E. La clonación se hizo cortando inserto y vector con

PmeI y ClaI. Una vez clonados se secuenció para confirmar las mutaciones y a estos plásmidos se les

denominó pFA-5´SEP7-2A/2E-ARG4/HIS1 (pC1339, pC1340, pC1342 y pC1344). Para la transformación de Candida se amplificó el casete de los vectores resultantes usando oligonucleótidos que recombinaran en la zona deseada (entre la región 5’ del gen y el inicio de la región codificante de SEP7).

• sep7-3A y sep7-8A. Se amplificó un casete para transformar Candida que insertaba la GFP detrás

del extremo C-terminal de Sep7 y al mismo tiempo generaba las mutaciones en el extremo C-terminal de SEP7. El casete se amplificó por PCR a partir de pFA-CaGFP-ARG4/HIS1 usando oligonucleótidos que recombinaban al final de la región codificante del gen introduciendo las mutaciones. Se utilizaron oligonucleótidos específicos que introducían 3 u 8 mutaciones.

• int-3A e int-3E. Se amplificó la región de 3’ del gen INT1 a partir de DNA genómico de BWP17 por PCR y se clonó en el vector pFA-HA-ARG4 usando los sitios PmeI-SpeI (pFA-HA-ARG4-3´INT1, pC1291). Se confirmaron las mutaciones por secuenciación. A continuación, se clonó la región codificante de INT1 (amplificada a partir de DNA genómico de BWP17) en el plásmido construido anteriormente, usando los sitios PvuII-SalI (pFA-ORFINT1-HA-ARG4-3’INT1, pC1302). Después se generaron dos versiones del plásmido anterior con las mutaciones int1-3A e int1-3E usando el Kit Quik Change Lightning Multi Site (Agilent Technologies). Estos plásmidos fueron denominados pFA-ORFINT1(3A)-HA-ARG4-3’INT1 y pFA-ORFINT1(3E)-HA-ARG4-3’INT1 (pC1303 y pC1309 respectivamente). Finalmente, se digirió el plásmido con PvuII-SpeI, se separó la banda deseada en gel agarosa y se transformó Candida en un fondo genético int1∆/INT1. Así se construyeron las versiones de int1-3A-HA e int1-3E-HA. Posteriormente se clonó el gen GFP a continuación de las mutaciones, amplificando el DNA de pFA-GFP-URA3 con oligonucleótidos que recombinaran en esa zona y transformando Candida (int1-3A-GFP e int1-3E-GFP).

4.2 Transformación de C. albicans.

Dos metodologías fueron usadas para introducir DNA en las diferentes cepas del hongo:

• Transformación con Acetato de litio. La transformación química se realizó como ha sido

previamente descrito por Walther y Wendland (2003), con algunas modificaciones. Los cultivos celulares de las cepas a transformar que habían crecido durante toda la noche se diluyeron en 25 ml de medio fresco a una densidad óptica a 600nm (OD₆₀₀) de 0,3 e incubadas con agitación a 28°C durante 3-4 h hasta alcanzar una OD₆₀₀ de 1,4-1,8. Las células se recogieron, se lavaron con 25 ml de agua destilada estéril y se resuspendieron en 1,5 ml de solución de acetato de litio (acetato de litio 100 mM,

Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM). La mezcla de transformación se hizo agregando 100 μl de células, 100 μg de DNA monocatenario (2 mg/ml), 1-5 μg de DNA a insertar en el genoma y 600 μl de solución PEG-LiAc (PEG 4000 al 50% en solución de acetato de litio). Esta mezcla se incubó toda la noche en agitación a 28°C antes de someterla a un choque térmico a 44°C durante 15 min. Las células se lavaron y se sembraron en medios selectivos.

• Transformación por electroporación. El protocolo de electroporación para C. albicans fue el

descrito por Reuss y colaboradores (2004). A partir de un pre-cultivo en YEPD de C. albicans, se realizó una dilución a OD₆₀₀=0,4 en 25 ml de medio fresco y se incubó con agitación a 28°C hasta llegar a 1,4-1,6 OD₆₀₀. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 25 ml de solución de acetato de litio (acetato de litio 0,1 M pH 7,5, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5 y DTT 10 mM). Después se incubaron 1 h a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron 3 veces con agua estéril fría y una vez con sorbitol 1 M. Estas células competentes se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 160 μl de sorbitol 1 M. La mezcla de electroporación, que contenía 50 μl de la suspensión de células competentes y 1-5 μg de DNA, se mantuvo durante 5 min en hielo. Entonces, se llevó a cabo la electroporación de las células competentes en un electroporador Gene pulser® de

Bio-Rad (cubetas de 0,2 cm a 1,5 kV). Después de la electroporación, las células se lavaron con 1 ml de

sorbitol y se sembraron en medios selectivos.

Para los dos tipos de transformaciones, cuando se usaba como selección el marcador SAT1, las células se incubaban en 1 ml de YEPD a 28°C en agitación con el fin de permitir su recuperación antes de ser sembradas en el medio con la nourseotricina.

4.3 Transformación de E. coli.

La transformación de la cepa bacteriana DH5α se realizó según el procedimiento descrito por Kushner (1978), basado en el choque térmico y mediante el uso del kit StrataClone Blunt PCR Cloning® (Agilent Technologies) siguiendo las instrucciones de la casa comercial.