Columnas de cromatografía de líquidos de alta temperatura.

Las fases estacionarias de HPLC poliméricas, de alúmina o de sílice, ampliamente usadas hoy en día, presentan una pobre resolución bajo algunas condiciones tales como alto pH de la fase móvil (>pH 8) o elevadas temperaturas de columna. Alternativamente, el zirconio (ZrO2) es químicamente estable en todo el rango de pH (1-14), y es térmicamente estable. La alta

estabilidad del zirconio y su selectividad cromatográfica lo hace adecuado para usarlo en HTLC.

La primera ventaja del zirconio sobre los rellenos poliméricos o de sílice, es su alta estabilidad térmica y química. A diferencia de la sílice, el zirconio es completamente estable en todo el rango de pH y a temperaturas altas como 200 ºC. En comparación a las fases estacionarias poliméricas, el zirconio no se contrae ni se expande en función del contenido orgánico de la fase móvil o de la fuerza iónica. Esta alta estabilidad da lugar a una columna que puede ser limpiada en condiciones extremas (ácidas o básicas), y también permite un mayor tiempo de vida de la misma. La columna permanecerá estable a altas temperaturas permitiendo análisis más rápidos y menor necesidad de modificadores orgánicos (ZirChrom Separations, Inc).

Gradiente de temperatura causante del ensanchamiento 150 ºC

150 ºC

Columna térmicamente equilibrada 150 ºC

150 ºC

125 ºC

Columna térmicamente no equilibrada

100 ºC

150 ºC

Diseño de calentamiento de columna erróneo

Zona central más fría

Algunas de las columnas que utilizan el zirconio en el relleno son la DiamondBond®-C18 y

la Zirchrom®-PBD (ZirChrom Separations, Inc). La DiamondBond®-C18 utiliza una tecnología

propia de enlace covalente para enlazar las cadenas C18 a la superficie de carbono dando una

importante estabilidad a la columna para aplicaciones a alta temperatura. Las cadenas se encuentran recubiertas de zirconio. Esta columna presenta una selectividad intermedia entre las de octadecilsilice (ODS) y las de los soportes de carbono no enlazados que son usados en fase inversa, y su principal utilidad es con compuestos ácidos y para aplicaciones de LC-MS.

La columna Zirchrom®-PBD presenta un relleno de polibutadieno (PBD) con un recubrimiento de zirconio sobre una fina capa de polímero. La selectividad química de las columnas de Zirchrom®-PBD es similar a la de una convencional de sílice C8 o C18 para analitos

no iónicos. Sin embargo, para analitos ionizables, existe la posibilidad de que se produzcan interacciones secundarias, lo cual puede usarse para cambiar la selectividad química de la columna por simple adición de aditivos a la fase móvil. Por el contrario, si el aditivo apropiado no se añade a la fase móvil, el resultado será un peor perfil de los picos o en casos extremos la completa adsorción de los analitos a la columna. Los tres tipos de sitios cromatográficos más importantes en la superficie del relleno de zirconio son, el ácido de Brönsted, la base de Brönsted y el ácido de Lewis (figura1.5-5). Sin embargo, con fines prácticos, los sitios de tipo ácido de Lewis son los dominantes en la superficie química del zirconio debido a la facilidad con la que estos sitios pueden adsorber los constituyentes de la fase móvil para formar una capa quimiadsorbida en la superficie de zirconio. Esto puede causar resultados cromatográficos pobres, debido a la posibilidad de que un analito sea adsorbido en estos sitios de forma irreversible, cuando no se trabaja en las condiciones adecuadas (ZirChrom Separations, Inc)

Otra columna frecuentemente utilizada es la PRP-1, que tiene como relleno de empaquetamiento el poli(estiren-divinilbenceno), un relleno polimérico que se puede utilizar en un gran número de aplicaciones, similares a las columnas C8 y C18 de fase inversa, siendo mejor que

estas cuando existen dificultades en el análisis: muestras a pH altos (>8), muestras reactivas o termolábiles, fases móviles con porcentaje acuoso alto (80-100% de agua) o con reactivos formadores de pares iónicos. El relleno es estable hasta presiones por encima de 30 MPa y los entrecruzamientos previenen que el relleno se expanda o se contraiga, lo cual es común en otras columnas poliméricas. Este relleno es estable en todo el rango de pH (0-14). Presentan una mejor recuperación de la muestra que las columnas basadas en sílice y tienen una excelente durabilidad, ya que son estables a cualquier concentración de agua o de disolvente orgánico. A diferencia de las columnas de sílice C8 y C18, la columna PRP-1 no presenta enlaces lábiles y, por

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tanto, no se produce hidrólisis de ésta, manteniendo la columna sus características de resolución durante más tiempo que cualquiera de las columnas de C8 y C18.

Ácido de Brönsted ZrOH + OH-- ZrO-- + H2O

Base de Brönsted Zr-O-Zr + H+ Zr-OH+-Zr Ácido de Lewis Zr(OH2) + --OOC-R ZrOOC-R + H2O

Otro relleno de fase inversa utilizado es el Pathfinder AP, material de empaquetamiento que conjuga la fuerza de las columnas de HPLC basadas en polímeros y en gel de sílice. Estas columnas presentan características de ambas, son químicamente inertes como las poliméricas y presentan una alta estabilidad y eficacia como las de gel de sílice. Con este relleno se eliminan los efectos desfavorables del silanol en las separaciones en HPLC. Se puede utilizar con 100% de agua y a elevadas temperaturas, incrementando la selectividad debido a la combinación de la fase inversa y a los mecanismos de interacción polar.

Z r O O O O H A Z r O O O O O H H O H H O H H C Z r O O O Z r O O O O H B

Figura 1.5-5. Estructura química de las especies mayoritarias presentes en la superficie de zirconio; ácido de Brönsted (A), base de Brönsted (B) y ácido de Lewis (C) (intercambio de ligandos).