Ventajas de la HTLC sobre la HPLC convencional.

En los últimos tiempos se ha demostrado que pequeños incrementos en la temperatura pueden producir mejoras drásticas, tanto en la eficacia como en la velocidad de la separación mediante HPLC. Las elevadas temperaturas utilizadas para conseguir amplias mejoras en la velocidad de análisis, predicha por algunos autores años atrás, principalmente, dan lugar a tres efectos: disminución de la viscosidad, incremento de la velocidad de difusión de los analitos y

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cinéticas más rápidas (Chen y Horvath, 1995). La primera de las ventajas se debe a que la disminución de la viscosidad de la fase móvil, debido al incremento de la temperatura, permite utilizar velocidades de flujo mayores sin que se produzcan incrementos en la presión del sistema, y así, reducir los tiempos de análisis (Smith y Burgess, 1997). El segundo efecto viene dado porque cuando se utilizan altas temperaturas, la velocidad de difusión de los analitos se incrementa, tanto en el interior como en el exterior de los poros del material de relleno, y por lo tanto la disminución de eficacia asociada con el incremento de la velocidad de flujo es mínima. Por último, a elevadas temperaturas, las cinéticas de las interacciones entre los analitos y la fase estacionaria son más rápidas. Todo esto contribuye a que los tiempos de análisis de todos los analitos sean menores y a menudo se reduzcan o eliminen las colas en los picos cromatográficos. Otra ventaja importante es que, a temperaturas elevadas, el agua puede ser usada como eluyente de polaridad media en cromatografía en fase inversa, como una alternativa a los eluyentes acuosos con modificadores orgánicos que se utilizan a temperatura ambiente (Smith y Burgess, 1997; Yan y col., 2000; Trones y col., 1999). Usando solamente agua como eluyente, también podemos evitar algunos problemas como toxicidad, inflamabilidad y altos costes relacionados al uso de disolventes orgánicos. El empleo de bajos contenidos de modificadores orgánicos permite el acoplamiento de esta técnica con bioensayos.

Un incremento de la temperatura de elución de unos 10-20 ºC tiene un gran efecto sobre la forma de los picos, aumentando la eficacia, pudiendo resolverse analitos que sólo se separan como un hombro a temperatura ambiente. Un incremento desde la temperatura ambiente hasta 50-60 ºC permite disminuir el tiempo de análisis a la mitad. Si elevamos la temperatura hasta los 100 ºC, aproximadamente, es posible disminuir los tiempos de análisis alrededor de 5 veces. Esto permite, además, que el tiempo de equilibrado de la columna sea mucho menor lo que permite realizar un mayor número de análisis (ZirChrom Separations, Inc., 2002). La HTLC es, por tanto, una poderosa herramienta de separación.

Durante años el control de la temperatura de la columna cromatográfica, en cromatografía de líquidos, ha sido una variable poco tenida en cuenta, a excepción de su control para aumentar la reproducibilidad de los tiempos de retención en aplicaciones concretas y no como variable para incrementar el poder de separación en los métodos desarrollados por HPLC (Li, 1998). Esto es debido a que un cambio en el factor de capacidad o factor de retención de la columna puede ser fácilmente realizado por variación en la composición de la fase móvil y, además, la mayoría de las columnas basadas en sílice no son térmicamente estables (Yang y col., 1998) y sólo pueden ser usadas a temperaturas ligeramente superiores a la ambiente (Li y Carr, 1997a). En general,

estas columnas permiten un incremento máximo de la temperatura de 30-40 ºC por encima de la temperatura ambiente (Fields y col., 2001). En un trabajo reciente (McCalley, 2000) se ha comprobado que se producen grandes incrementos en la eficacia de la separación de compuestos básicos a altas temperaturas. Los autores sugieren que los compuestos básicos podrían ser analizados a altas temperaturas y que habría que desarrollar nuevas columnas que fuesen estables a altas temperaturas. Debido a la disponibilidad, en la actualidad, de columnas térmicamente estables, el uso de la temperatura como variable de separación, para mejorar la selectividad y la velocidad de separación, está incrementándose últimamente.

En los últimos años, se han desarrollado fases estacionarias de alta estabilidad térmica basadas en zirconio, como los soportes de HPLC en fase inversa (RP-HPLC) de polibutadieno (Yan y col., 2000; Li y Carr 1996; Sun y Carr, 1995) y de poliestireno recubiertos de zirconio. Se han realizados varios estudios sobre la eficacia, selectividad y propiedades termodinámicas a altas temperatura, del polibutadieno recubierto de zirconio (PBD-ZrO2) (Li y col., 1997d; Li y Carr,

1997a; Sun y Carr, 1995; Li y Carr, 1997b; Li y Carr, 1997c; Dolan, 2002). Con estas columnas, los tiempos de análisis se pueden mejorar en un amplio rango, utilizando temperaturas y velocidades del flujo altas (350 ºC y 1 mL/min., respectivamente), con unas pequeñas perdidas de resolución en comparación con la HPLC convencional operando a velocidades del flujo normales (Yang y col., 1998; Smith y Burgess, 1997; Sun y Carr, 1995).

Las altas temperaturas pueden mejorar la eficacia de la columna hasta en un 30%, teniendo lugar esta mejora, principalmente, en la región de velocidad de flujo lineal más alta (Li y col., 1997d). A una velocidad de flujo fija, la eficacia de la columna a temperaturas bajas es mejor que a temperaturas altas (ecuación 1.5-1). Esto se debe a que la difusión longitudinal molecular (término B) es más pronunciada a altas temperaturas y a bajas velocidades de flujo, debido a la interacción de moléculas con las paredes de la columna, dando como resultado, según la ecuación de Van Deemter, una menor eficacia a altas temperaturas. En la región de velocidad de flujo lineal alta, en donde la velocidad de transferencia de masa (término C) es mayor, la contribución del término B no es significativa. Debido a esto, es conveniente operar sobre las columnas a altas velocidades de flujo y temperaturas altas, de tal manera que no sólo se mejorará la velocidad de separación, sino que también incrementará la eficacia de la columna debido a la minimización de la contribución de la difusión longitudinal.

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