Determinaciones Cuantitativas.

2.2.1. Cuantificación del nitrógeno total.

La determinación del nitrógeno total ha sido realizada mediante el método Kjeldahl, con un sistema de digestión Tecator y un autoanalizador Kjeltec 1030 (Tecator AB, Höganäs, Suecia).

2.2.2. Cuantificación del nitrógeno de compuestos nitrogenados de alto peso molecular.

La concentración de los compuestos nitrogenados de alto peso molecular (HMWN) ha sido determinada por medio del método de Bradford (Bradford, 1976), el cual se basa en la reacción de dichos compuestos con el reactivo azul de comassie G-250. Mediante este método se determinan los compuestos de peso molecular mayor de 3000 Da. La absorbancia se mide a 595 nm, a los 15 minutos de adicionar el reactivo sobre la muestra. Los resultados se han expresado en mg de nitrógeno perteneciente a compuestos de alto peso molecular por litro. La seroalbumina bovina (BSA) se ha utilizado como solución patrón. En la expresión de los resultados se ha tenido en cuenta tanto el peso molecular de la BSA (66432 g/mol) como el número de átomos de nitrógeno presentes en la molécula (10276 g/mol).

2.2.3. Cuantificación del nitrógeno de los aminoácidos libres.

Se ha llevado a cabo mediante el método descrito por Doi y col. (1981) (Método C, Ninhidrina-Cd), el cual se basa en la reacción de los grupos amino de los aminoácidos libres en medio ácido con una solución etanólica de ninhidrina con CdCl2. La absorbancia se mide a 507

nm.

2.2.4. Cuantificación del nitrógeno de los aminoácidos libres más péptidos.

Se ha seguido el método descrito por Doi y col. (1981) (Método Ninhidrina Convencional), basado en la reacción de los grupos α- y ε- amino primarios libres de péptidos y aminoácidos al reaccionar con una solución de ninhidrina con SnCl2. La absorbancia se mide a 570 nm.

2.2.5. Cuantificación del nitrógeno de péptidos.

2.2.5.1. Estudio de la fracción nitrogenada.

La concentración del nitrógeno de los péptidos se ha determinado por la diferencia entre el nitrógeno total (punto 2.2.1.) y la cantidad de nitrógeno correspondiente a las proteínas y a los aminoácidos libres (puntos 2.2.2. y 2.2.3., respectivamente).

2.2.5.2. Estudio de la bioactividad.

La concentración del nitrógeno de los péptidos se ha determinado por la diferencia entre el nitrógeno de los aminoácidos libres más péptidos (punto 2.2.4.) y el nitrógeno de los aminoácidos libres (punto 2.2.3.).

Para las determinaciones de los puntos 2.2.2., 2.2.3. y 2.2.4. se ha utilizado un espectrofotómetro DU 800 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA), y la leucina (14 g de nitrógeno por cada 131,2 g de leucina) ha sido utilizada como compuesto patrón.

2.2.6. Análisis de aminoácidos libres por cromatografía de líquidos de alta eficacia.

El análisis de los aminoácidos libres se ha realizado por cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC), mediante una reacción de derivatización precolumna, con ortoftaldialdehído (OPA) en presencia de 2-mercaptoetanol, según el método descrito por González de Llano y col. (1991). Las reacciones se han realizado consecutivamente de forma automatizada.

Para el análisis se ha empleado un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia, compuesto por una bomba 600 Controller, un desgasificador en línea y un inyector automático WISP 717 Plus (Waters Corporation, Milford, MA, USA) y un detector de fluorescencia de longitud de onda variable HP 1046-A (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA, USA), conectados a un ordenador personal con el programa Millenium v32 de Waters, con el que se ha controlado el sistema cromatográfico y se ha realizado la adquisición y el procesamiento de los datos. La detección de los OPA derivados se ha realizado a una longitud de onda de excitación de 340 nm y de emisión de 425 nm. Se ha utilizado una precolunma Nova-Pak C18 de Waters, 20 mm de

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longitud x 3,9 mm de d.i., 60 Å, 4 µm y una columna Nova-Pak C18 de Waters, 150 mm de

longitud x 3,9 mm de d.i., 60 Å, 4 µm.

Para la preparación del reactivo derivatizante ortoftaldialdehído-mercaptoetanol (OPA- MCE), se disuelven 200 mg de OPA en 9 mL de metanol, y se llevan a 10 mL con tampón borato 400 mM, pH 10. Se adicionan 160 µL de 2-mercaptoetanol. La solución se almacena en frío durante 24 horas antes de su uso, y posteriormente se filtra con un filtro PVDF Millex-HV (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) de 0,45 µm de tamaño de poro.

Se han utilizado dos eluyentes, el eluyente A formado por metanol/tampón fosfato sódico (10 mM, pH 7,3)/tetrahidrofurano (19:80:1) (v:v:v), y el eluyente B formado por metanol/tampón fosfato sódico (10 mM, pH 7,3) (80:20) (v:v).

Para la formación automática precolumna de los compuestos OPA derivados, se inyectan 12 µL de la disolución de OPA-MCE, los cuales quedan retenidos en el bucle del inyector, y al minuto se inyectan 20 µL de muestra convenientemente diluida en tampón borato 400 mM, pH 10. Las condiciones iniciales del gradiente, con flujo de 0,1 mL/min, permiten la reacción del OPA con la muestra. El gradiente lineal que se ha realizado para la elución de los compuestos se muestra en la tabla 2.2-1. El análisis cuantitativo, realizado por duplicado, se ha llevado a cabo utilizando el método del calibrado externo, obteniendo una recta de calibrado para cada uno de los aminoácidos determinados. Las muestras, previamente al análisis, han sido filtradas con un filtro PVDF Millex-HV (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) de 0,45 µm de tamaño de poro.

2.2.7. Análisis de aminoácidos totales por cromatografía de líquidos de alta eficacia.

El análisis de los aminoácidos totales se ha realizado por cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC), realizando, previamente, la hidrólisis ácida de las muestras. El volumen de muestra para la hidrólisis ha sido de 500 µL, añadiéndose a ésta, 500 µL de HCl concentrado (concentración final, 6M) y 10 µL de ácido tioglicólico, en una atmósfera de N2 durante 24 horas a 110 ºC. Posteriormente, la muestra ha sido llevada a sequedad con un

equipo de concentración Büchi (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suiza), compuesto de Baño de Calor B-490, Rotavapor R-250 y controlador de Vacío V-800. A continuación, la muestra se reconstituye en 500 µL de tampón borato (400mM, pH 10) y los aminoácidos se analizan siguiendo el método descrito en el punto 2.2.6.

Tabla 2.2-1. Gradiente utilizado en la derivatización y separación de aminoácidos por RP-HPLC.

Tiempo (min) Flujo (mL/min) Eluyente A Eluyente B

0,0 0,0 100 0 1,0 0,1 100 0 2,5 1,5 100 0 7,5 1,5 85 15 12,5 1,5 85 15 17,5 1,5 70 30 21,5 1,5 60 40 33,5 1,3 20 80 39,5 1,3 20 80

2.2.8. Análisis de aminas biógenas por cromatografía de líquidos de alta eficacia.

El análisis de las aminas biógenas se ha realizado por cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC), utilizando el método descrito por Marcobal y col. (2005), mediante una reacción de derivatización precolumna, con ortoftaldialdehído (OPA) en presencia de 2-mercaptoetanol, dando lugar a un compuesto que se detecta mediante fluorescencia. Las reacciones se han realizado consecutivamente de forma automatizada.

Para el análisis de las aminas se ha empleado el mismo equipo y las mismas columnas descritas en el punto 2.2.6. Para la preparación del reactivo derivatizante ortoftaldialdehído- mercaptoetanol se disuelven 350 mg de OPA en 47,5 mL de metanol y se añaden 2,5 mL de 2- mercaptoetanol. La solución se ha almacenado en frío durante 24 horas antes de su uso, y posteriormente se ha filtrado con un filtro PVDF Millex-HV (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) de 0,45 µm de tamaño de poro. Se han utilizado dos eluyentes, el eluyente A formado por tampón fosfato sódico (10 mM, pH 8,3) y el eluyente B formado por un 1% de 2-octanol en acetonitrilo y eluyente A (70:30) (v/v).

Para la formación automática precolumna de los compuestos OPA derivados, se inyectaron, sucesivamente, 6 µL de tampón borato (400 mM, pH 10,5), 12 µL de la disolución de OPA-MCE y 16 µL de muestra, convenientemente diluida, los cuales quedaron retenidos en el

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bucle del inyector durante dos minutos para que se produzca la reacción antes de llegar a la columna. El gradiente lineal utilizado para la elución de los compuestos se muestra en la tabla 2.2-2. El análisis cuantitativo se ha llevado a cabo utilizando el método del calibrado externo, obteniendo una recta de calibrado para cada una de las aminas determinadas. El patrón de calibrado empleado se ha preparado en etanol 10%. Los análisis han sido realizados por duplicado y las muestras han sido previamente filtradas con un filtro PVDF Millex-HV (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) de 0,45 µm de tamaño de poro.