Chitinases are enzymes belonging to pathogenesis-related (PR) proteins that are attractive for biotechnology due to their inhibitory activities against different phytopathogens. Here the isolation of an 1410 bp long genomic sequence encoding chitinase from the insectivorous sundew (Drosera rotundifolia L.) using degenerative PCR approach and Genome Walking kit is presented. The sequence comparison using Blastx revealed the presence of two introns of 110 bp and 552 bp length. The highest similarity on protein level (65% identities, 74% positives) was found to basic chitinase isolated from carnivorous plant Nepenthes khasiana. The sundew chitinase gene is one of the first nucleic sequences from this particular plant that in addition encodes for a putative plant defense gene.
Keywords: gene isolation, chitinase, primary structure, sundew
Úvod
Patogénne huby, ich adaptabilita na chemické fungicídy a zvýšený záujem verejnosti o škodlivý vplyv týchto zlúčenín na životné prostredie a ľudské zdravie, má za následok upriamenie pozornosti na bezpečnejšie, a teda prijateľnejšie alternatívne riešenia z hľadiska životného prostredia, ktoré zahrňujú aj hľadanie nových prírodných látok s antifungálnou aktivitou. Obmedzenia vplyvu rôznych škodcov na kultúrne rastliny pomocou biologicky aktívnych látok sa javí ako sľubná alternatíva ku chemickým pesticídom (MELCHERS a kol., 2000). Revolúcia v biotechnologiách priniesla značný záujem o identifikáciu a izoláciu génov, ktoré kódujú biologicky aktívne látky. Medzi takéto gény sa zaraďuje aj skupina génov kódujúcich hydrolytické enzýmy, glukanázy a chitinázy, ktorých jedna z funkcií spočíva v degradácii bunkovej steny patogénnych húb, čím dochádza k redukcii ich rastu (JOOSTEN a kol., 1995). Medzi málo preskúmané rastlinné druhy so silným antifungálnym potenciálom patrí mäsožravá rastlina rosička okrúhlolistá (Drosera rotundifolia L.) z rodiny Droseraceae, genus Drosera. Z tohoto dôvodu, našu pozornosť sme zamerali na izoláciu sekvencie chitinázy z mäsožravej rastliny rosičky okrúhlolistej, ktorá je bohatým zdrojom látok s antifungálnou aktivitou.
Materiály a metódy
Vnútorný fragment chitinázy z rosičky okrúhlolistej sme izolovali pomocou PCR s degenerovanými
primermi FOR 5´TTIGGICA(AG)ACI(AT)(GC)ICA(CT)GA(AG)AC 3´ a REV5´ATGGTACC(CG)(AT)CATCCA(AG)AACCAIA(ATG)IGCTG. PCR program zahrňoval 1 cyklus
940C 2 min; 35 cyklov [940C 30 s, 530C 40 s; 720C 90 s] 720C 10 min.
Pomocou Genome WalkingTM Kitu (Clontech) sme následne pomocou špecifických primerov pre
chitinázu navrhnutých na základe parciálnej sekvencie chitinázy a adaptorových primerov nested PCR reakciou vyizolovali 5´upstream a 3´ downstream fragmenty chitinázy. V prípade 5´upstream sekvencie sme najprv genómovú DNA štiepili restrikčnou endonukleázou Pvu II. Po ligácii adaptora k restrikčným fragmentom sme 0.075 µg DNA použili na amplifikáciu fragmentu v PCR reakcii, kde sme ako forwardový primer použili primer navrhnutý v sekvencii adaptora výrobcom kitu a reverzný špecifický primer so zložením: Chit REV 5´ ATATGGACCATCTGGTGCAGTTGG 3´.
PCR program zahrňoval 1 cyklus 940C 3 min; 35 cyklov [940C 25 s, 620C 30s, 720C 90s;] 720C 10 min.
V prípade 3´ downstream sekvencie sme najprv genómovú DNA sme štiepili restrikčnou endonukleázou Stu II.
Po ligácii adaptora k restrikčným fragmentom sme 0.075 µg DNA použili na amplifikáciu fragmentu v PCR reakcii, kde sme ako reverzný primer použili primer navrhnutý v sekvencii adaptora výrobcom kitu a forwardový špecifický primer so zložením: Chit FOR 5´GCATCCGAATGATAATGACAGTGG 3´. PCR program zahrňoval 1 cyklus 940C 3 min; 35 cyklov [940C 25 s, 620C 30s, 720C 90s;] 720C 10 min.
Následne sme produkty PCR reakcií izolovali z gélu pomocou Gél extrakčného kitu firmy QIAGEN, klonovali do pGem–T vektorového Systému II (Promega), a komerčne sekvenovali pomocou M13 primerov. Získanú sekvenciu sme analyzovali pomocou programov GENSCANWhttp://genes.mit.edu/GENSCAN.html a BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
Výsledky a diskusia
Prítomnosť chitináz v sekréte tráviacich žliaz mäsožravej rastliny Drosera rotundifolia predpokladá prítomnosť a aktivitu týchto enzýmov tak pri procesoch trávenia hmyzu, ako aj pri obrane rastliny voči fytopatogénnym hubám či baktériám (JUNIPER a kol., 1989). Experimenty sme preto zamerali na izoláciu a identifikáciu génu pre chitinázu v rosičke okrúhlolistej s cieľom v budúcnosti ju podrobnejšie charakterizovať, prípadne využiť na cielenú transgenózu.
V prvom kroku PCR reakciou s degenerovanými primermi, ktoré boli navrhnuté v konzervatívnej oblastiach rastlinných chitináz, sme amplifikovali 987 bp DNA fragment. Po jeho klonovaní do pGem-T vektora, sekvenácii a následne pomocou BLAST analýzy sme odhalili, že DNA fragment kóduje časť sekvencie chitinázy.
Na základe získanej DNA sekvencie sme navrhli nové špecifické primery a pomocou Genome WalkingTM
Kitu v PCR reakciách sme amplifikovali DNA fragmenty zodpovedajúce 5´a 3´ DNA koncovým sekvenciám príslušného génu.
Ďalšie analýzy ukázali, že získaná genómová chitináza izolovaná z mäsožravej rastliny Drosera
rotundifolia je kódovaná 1410 pármi báz. Porovnaním preloženej sekvencie s databázou proteínov v Blastx
sme zistili, že sekvencia obsahuje dva intróny o veľkosti 110 a 552 bp. Najväčšiu zhodu na proteínovej úrovni (65% identít a 74% pozitív) vykazuje izolovaná chitináza s bázickou chitinázou mäsožravej rastliny
Nepenthes khasiana.
Nukleotidová sekvencia kóduje proteín zložený z 269 aminokyselín. Proteínová sekvencia obsahuje Chitín viažúcu doménu, ktorá zohráva úlohu pri väzbe chitínových subjednotiek a. glykozid hydroláza „family“ 19 chitinázovú doménu. Hoci predbežná analýza pomocou GENSCANu (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) naznačila, že izolovaná sekvencia obsahuje kompletnú sekvenciu od translačného štartovacieho kodónu po stop kodón, porovnaním sekvenčnej homológie s inými chitinázami z Génovej banky http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sme zistili, že pravdepodobne časť 3´sekvencie z kompletného chitinázového génu chýba. Následne preto svoju pozornosť upriamime na izoláciu chýbajúcej časti génu pomocou novo navrhnutých špecifických primerov a Genome WalkingTM Kitu.
Záver
Izolovaný gén kódujúci chitinázu z Drosera rotundifolia predstavuje jeden z prvých génov izolovaných z genómovej DNA tohto rastlinného druhu. Po kompletizácii génu sa sústredíme na izoláciu cDNA klonu, jeho klonovanie do expresného vektora a enzýmovú a antifungálnu charakterizáciu príslušného proteínu.
Literatúra
1. MELCHERS, L.S. – Stuiver, M.H.: Novel genes for disease-resistance breeding. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 2000, 147-152.
2. JOOSTEN, M.H.A.J. – VERBAKEL, H.M. – NETTEKOVEN, M.E. – Van LEUWEN, J. - Van Den VOSSEN, R.T.M. – De WIT, P.J.G.M.: The phytopathogenic fungus Cladosporium fulvum is not sensitive to the chitinase and β-1,3-glucanase defence proteins of its host, tomato. Physiol.Mol. Plant
Pathol. 46, 1995, 45-49.
3. JUNIPER, B.E. – ROBINS, R.J. – JOEL, D.M.: The carnivorous plants. Academic Press, London, 1989, 1-392
Práca bola vypracovaná v rámci projektu VEGA 2/5034/25.
________________________ Adresa autora:
Ing. Jana Libantová, CSc. Ústav genetiky a biotechnológií rastlín SAV, Akademická 2, P.O. Box 39A, 950 07 Nitra 153