Genetically modified maize is grown extensively in the world today. Qualitative and semi-quantitive polymerase-chain reaction-based methods to detect genetically modified maize (MON 810 Yield Gard corn) were applied to processed education at Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno (MUAF Brno). In this study we reported the optimalisation of qualitative and semi-quantitive detection of insect resistant corn variety (MON810) for technical equipment in Department of Plant Biology at MUAF Brno.
Key words: qualitative detection, semi-quantitive detection, transgenic maize, MON810 Úvod
S rozvojem pěstování geneticky modifikovaných rostlin (GMR) roste i požadavek (ze zákona) na jejich identifikaci, rozlišení a značení. Detekci transgenu lze provádět pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Kvalitativní detekci GMR, tzn. rozlišení modifikovaných a nemodifikovaných odrůd, lze provést na základě specifické PCR pro oblasti použitého konstruktu (VAUGHN et al., 2005). Aplikaci metodiky u hybridů kukuřice odvozených od MON810 uvádějí HOLCK et al. (2002) a HERNÁNDEZ et al. (2003). Pro přesnou kvantifikaci DNA z GMR ve vzorku osiva nebo v produktu je pak nutné realizovat, přístrojově a materiálově finančně náročnější, real-time PCR (MA et al., 2005; YANG et al., 2005).
Cílem práce byla optimalizace kvalitativní a semikvantitativní detekce Bt-kukuřice (MON810) pomocí PCR pro výukové účely.
Materiál a metody
Pro kvalitativní a semikvantitivní detekci geneticky modifikované kukuřice byly použity dva genotypy kukuřice firmy Monsanto. Jednalo se o modifikovaný hybrid na bázi MON810 a nemodifikovanou kontrolu (izogenní linie ke GM kukuřici). Získané osivo bylo předmětem „MTA“ mezi Monsanto Europe s.a. a MZLU v Brně ze dne 26.5.2008. Pro molekulární analýzy byla genomová DNA izolována pomocí izolačního kitu DNAesy Plant Mini Kit (f. Qiagen) z napěstovaných rostlin ve fázi jednoho listu (10 dní staré rostliny). Napěstování a izolace genomové DNA probíhala v prostorách určených pro práci s GMO. Koncentrace DNA ve vzorku byla po izolaci zjištěna spektrofotometricky. Pro analýzy bylo použity primery popsané GREINEREM et al. (2005). Reakční směs o celkovém objemu 25 μl obsahuje: 30 ηg templátové DNA, 0,5 U Taq polymerázy (Promega, USA), 1x odpovídající pufr, 7,5 μM každého primeru a 0,1 mM každého dNTP. Teplotní a časový profil reakce byl: 1 cyklus 95oC – 600 s; 40x (95oC – 30 s, 64oC – 30 s, 72oC – 30 s); 72oC – 420 s. V případě semikvantitivního stanovení byl odebrán vzorek amplifikačního produktu po 26., 28., 30., 32., 34. a 40. cyklu. Pro vizualizaci produktů byla využita elektroforéza na 1,5% agarozovém gelu (barvení ethidiumbromidem). Výsledné elektroforetogramy byly digitalizovány pomocí CCD kamery a PC.
Výsledky a diskuse
Prvním krokem pro zavedení PCR-metod detekce GM kukuřice byla optimalizace protokolu pro detekci kukuřičného genomu a detekci specifické oblasti geneticky modifikované kukuřice MON810. Různí autoři popsali mnoho primerových kombinací, které mohou sloužit k tomuto účelu. My jsme vybrali pro detekci genomu kukuřice primery IVR1-F a IVR1-R (invertase gene), které verifikují přítomnost kukuřičného genomu produktem o velikosti 226 bp (obr. 1a). Pro kvalitativní detekci kukuřice MON810 byla vybrána sekvence CaMV promotoru (primery VW01 a VW03), kdy přítomnost verifikuje produkt o velikost 178 bp (obr. 1b).
V další části naší práce jsme přistoupili k optimalizaci semikvantitativní detekce Bt-kukuřice. Byla vytvořena řada směsných vzorků s různým podílem genomu geneticky modifikované kukuřice v anazylovaném vzorku. Jako detekční limit se nám jevila podle našich výsledků hranice 1%. Stejný detekční limit při použití shodných primerů uvádějí Greiner et al. (2005). Následně byl optimalizován odběr vzorků pro semikvantitativní detekci Bt-kukuřice ve vzorku. Na základě dosažených výsledků můžeme doporučit odběr amplifikačního produktu mezi 26. až 34. cyklem (obr. 2).
Závěr
V práci jsou prezentovány výsledky optimalizace kvalitativní a semikvantitivní detekce Bt-kukuřice (MON
810). Optimalizované protokoly umožní využití postupů v praktické výuce genetických předmětů na Ústavu biologie rostlin AF MZLU v Brně a jsou přípravným krokem pro zavedení praktických úloh pro kvantifikaci geneticky modifikovaných organismů pomocí real-time PCR.
Nové poznatky z genetiky a šľachtenia poľnohospodárskych rastlín Zborník z 15. vedeckej konferencie, Piešťany : VÚRV, 2008
189 Adresa autora: Ing. Tomáš Vyhnánek, Ph.D., Ing. Pavel Hanáček, Ph.D., Doc. Ing. Jan Bednář, CSc., Ústav biologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika, e-mail: [email protected]; [email protected]
a) b)
Obrázek 1: (a) specifická detekce kukuřičného genomu, (b) specifická detekce GM kukuřice M – velikostní marker; 1 až 4 – izogenní línie kukuřice; 5 až 7 – GM kukuřice
Obrázek 2: Elektroforetogram vzorků s rozdílným procentickým zastoupením GM kukuřice ve vzorku po 26., 28., 30., 32, 34. a 40. cyklu
A – 1%; B – 5%; C – 10%; D – 25%; E - 50%, F – 100% obsah GM kukuřice ve vzorku
Literatura
Greiner, R., Konietzny, U., Villavicencio, A.L.C.H. (2005) Qualitative and quantitative detection of genetically modified maize and soy in processed foods sold commercially in Brazil by PCR-based methods. Food
Control, 16: 753-759.
Hernández, M., Pla, M., Esteve, T., Prat, S., Puigdomenech, P., Farrado, A. (2003) A specific real-time quantitative PCR detection system for event MON810 in maize YieldGard® based on the 3´-transgene integration sequence. Transgenic Res., 12: 179-189.
Holck, A., Va, M., Didierjaen, L., Rudi, K. (2002) 5´-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified Mon810 MaisGard maize. Eur. Food Res. Technol., 214: 449-453.
Ma, B.L., Subedi, K., Evenson, L., Stewart, G. (2005) Evaluation of detection methods for genetically modified traits in genotypes resistant to European corn borer and herbicides. J. Environ. Sci. and Health, 40: 663-644. Yang, L., Xu, S., Pan, A., Yin Ch., Zhang, K., Wang, Z., Zhou, Z., Zhang, C. (2005) Event Specific Qualitative
and Quantitative Polymerase Chain Reaction Detection of Genetically Modified MON863 Maize Based on the 5´-Transgene Integration Sequence. J. Agric. Food Chem., 53: 9312-9318.
Vaughn, T., Cavato, T., Brar, G., Coombe, T., Degooyer, T., Ford, D.S., Groth, M., Howe, A., Johnson, S., Kolacz, K., Pilcher, C., Purcell, J., Romano, C., English, I., Pershing, A.J. (2005) Method of controlling corn rootworm feeding using a Bacillus thuringiensis protein expresed in transgenic maize. Crop Sci., 45: 931- 938.
*Práce vznikla za finanční podpory rozvojového projektu FRVŠ MŠMT č. 1686/F4a/2008.
M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7 226 bp 176 bp M 26 28 30 32 34 40 D F M 26 28 30 32 34 40 26 28 30 32 34 40 26 28 30 32 34 40 26 28 30 32 34 40 M 26 28 30 32 34 40 M A B D C E F
190 Adresa autora: Katedra biológie a ekológie, PF KU, Nám. A. Hlinku 56/1, 034 01 Ružomberok, e-mail: [email protected]