Construcción de la cepa mutante en CcpA.

Para disrumpir el gen ccpA en la Cepa 13, se procedió a la amplificación de un fragmento interno de 760 pb del gen ccpA mediante PCR usando los cebadores CCP-F y CCP-R (Tabla 4). El fragmento así obtenido fue clonado en el sitio SmaI del plásmido pUC18 para crear el plasmido mutador pKO1 (Tabla 2). Luego se insertó un cassette de resistencia a Eritromicina (ermBP) en el sitio HincII de pKO1 para poder realizar la selección de transformantes, creando así el plásmido pKO2 (Tabla 2). pKO2 (el cual no tiene origen de replicación en C. perfringens) se introdujo por electroporación (Sección 3.9.) y posterior selección con Eritromicina (Sección 3.7.) en la Cepa 13. Una vez obtenido el clon mutante denominado KO13, este fue analizado para determinar la

82 correcta inserción mediante un simple evento de recombinación homóloga entre el vector mutador suicida pKO2 y el gen ccpA (Figura 14). La inactivación insercional del gen ccpA en KO13 se demostró primeramente por análisis del ADN de la mutante por PCR. Se amplificó un fragmento de 1,6 Kb a partir de ADN de KO13 usando los cebadores P1 y M13F (Figura 14B, calle 2, Tabla 4) y un fragmento de 2,5 kb usando P2 y M13R (Figura 14B, calle 3, Tabla 4). Sin embargo, no se obtuvo producto de PCR utilizando los cebadores P1 y M13R o P2 y M13F (Figura 14B, calles 1 y 4 respectivamente, Tabla 4). Estos resultados de PCR fueron consistentes con una integración del plasmido suicida pKO2 dentro del gen ccpA salvaje en KO13. Los análisis por Southern blot (Sección 3.16.1.) mostraron que un fragmento de 2,4 kb de ADN digerido con HindIII de la Cepa 13 hibridizó con la sonda específica ccpA. Por otro lado, se obtuvieron dos bandas de hibridización cuando se utilizó ADN-HindIII de la cepa KO13, de 2,9 Kb y 4,3 Kb (Figura 14C). Este perfil fue consistente con un resultado esperado debido a que el plásmido pKO2 insertado tiene un sitio HindIII, generando en el cromosoma tres sitios de corte por HindIII (Figura 14A), los cuales darían origen a dos bandas luego de la disgestión con esta enzima de restricción.

3.16.1. Southerm blot de la mutante KO13.

Se amplificó por PCR un fragmento interno de ADN del gen ccpA de 350 pb a partir de la Cepa 13, usando los cebadores KO-F y KO-R (Tabla 4) marcados con fosfatasa alcalina empleando el sistema de marcado directo y detección Gene Images AlkPhos (Amershan Bioscience) (Waters, M. et al., 2005; Philippe, V. A. et al., 2006). La sonda así obtenida fue usada para determinar la inserción del plásmido mutador (Figura 14). Las muestras de ADN de las cepas de C. perfringens (Cepa 13 y KO13) se prepararon como describe Czeczulin, J. R. y colaboradores, 1996, y Sparks, S. G. y colaboradores, 2001. El ADN obtenido fue digerido con HindIII y separado por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. El ADN digerido fue transferido mediante Southern blotting. El film conteniendo el ADN-HindIII transferido fue hibridizado con la sonda ccpA marcada con AlkPhos, realizándose la detección de la sonda hibridada mediante CDPstar chemiluminescence (Amershan Bioscience) (Dr. Kaori Ohtani).

83

Figura 14:Construcción y caracterización molecular de la cepa mutante knock-out en ccpA de

C. perfringens (KO13, Tabla 2). (A) Diagrama esquemático mostrando la estrategia utilizada para construir la cepa mutante ccpA. P1, P2, M-13F y M-13R indican la localización de los cebadores usados para los análisis por PCR (Tabla 4). H y E indican los sitios HindIII y EcoRI, respectivamente. Se muestra la localización de la sonda específica para la porción perteneciente al N-terminal de la proteína codificada por ccpA. (B) Análisis por PCR del ADN aislado de la mutante KO13 usando los cebadores P1 y M13R (calle 1), P1 y M13F (calle 2), P2 y M13R (calle 3) y P2 y M13F (calle 4). Se indica en el gel el peso molecular de las distintas bandas del marcador en kilobases (Kb). (C) Análisis por Southern blot de ADN extraído de la

Cepa 13 (salvaje) y de la cepa KO13 (mutante isogénica en ccpA de la Cepa 13) digerido con

HindIII. El Southern blot fue analizado con la sonda específica de ccpA de 350 pb marcada con AlkPhos (Sección 3.16.1.). S y M indican las calles donde se colocó ADN de la Cepa 13 (salvaje) y de la mutante KO13, respectivamente. La migración según el peso molecular de las bandas de hibridización deribadas de las dos cepas (Cepa 13 y KO13) se indican a la derecha del blot (Cortesía del Dr. Kaori Ohtani).

84

Tabla 4. Cebadores oligonucleótidos usados en este estudio.

Cebador Secuencia del cebadora Posiciónb Gen Usoc CPP53 5’ GCGTCGACGAGATATGGTCTTTTAGATGG 3’ - 333 a -312 pilT promotor GUS

CPP55 5’ GCTGCAGCAGATGCTCCTTCTTTAACTG 3’ + 28 a + 48 pilT promotor GUS

CPP230 5’ GCGTCGACCTTGAAGATTTAGATAAGCCTC 3’ +19 a +41 pilD promotor GUS

CPP231 5’ GCTGCAGCCTTCCAATTATTAATCCAAATAA 3’ -361 a -341 pilD promotor GUS

Pro-plcup 5’ATAAGTGAATTCTAGGTTAAAACCTG3’ plc promotor GUS

Pro-plcdw 5’ACAAATCTGCAGCTTACAAATCTTTCTTTTC3’ plc promotor GUS

Pro-pfoup 5’TAGTGAATTCAAATTCCATAAATGGAAC3’ pfoA promotor GUS

Pro-pfodw 5’GCCACTGCAGTACTTGCTATTAATTTTG3’ pfoA promotor GUS

CCP-F 5’ AACTAGGATATAGACCTAAT 3’ + 172 a + 192 ccpA PM

CCP-R 5’ TGATCCCATATCATACATTG 3’ + 876 a + 896 ccpA PM

KO-F 5’ CTGGAGTGTCAATAGCAAC 3’ + 34 a + 53 ccpA SONDA

KO-R 5’ TCTCCTAGTGATGAACTCAT 3’ +366 a + 386 ccpA SONDA

CPP265 5’ ATATCCATCAAGTTCATCTATAGAG 3’ - 505 a - 481 ccpA COMP

CPP266 5’ TATGTTACCTAATGATTATGCATT 3’ + 1012 a + 1036 ccpA COMP

P1 5’ ATGCTGATTACTCAGAAGCT 3’ - 774 a - 754 ccpA PCR

P2 5’ CTCATAAGCCCTTGATGAAC 3’ + 1461 a + 1484 ccpA PCR

M13-F 5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’ PUC18 vector PCR

M13-R 5’ CAGGAAACAGCTATGAC 3’ PUC18 vector PCR

pilA1up 5’ AATGGTTATGGATCCAAATTTTTC 3’ pilA1 RT-PCR

pilA1dw 5’ AAGTATATTTAAGCTTCAGACACTG 3’ pilA1 RT-PCR

pilA2up 5’ CAATAGCGGTACCAAATTTCTTGTC 3’ pilA2 RT-PCR

pilA2dw 5’ TTGCTGAAGCTTATGTATTTGAAGG 3’ pilA2 RT-PCR

pilTup 5’ GAAAAGTATGATGCTATTGG 3’ pilT RT-PCR

pilTdw 5’ AGTTGAAAATACTAAGTGTCC 3’ pilT RT-PCR

plcup 5’CAATTAGGTTCTACTTATCCAG3’ plc RT-PCR

plcdw 5’AGTTAGCTAAAGTTACCTTTGC3’ plc RT-PCR

pfoup 5’CATTACAACTTGCAGATAAAGC3’ pfoA RT-PCR

pfodw 5’TCCATAAGCTACATTTGAAACC3’ pfoA RT-PCR

cp16Sup 5’TTTCGAAAGGAAGATTAATACC 3’ ARN 16S Control

RT-PCR

cp16Sdw 5’CAACTTAATGGTAGTAACTAAC3’ ARN 16S Control

RT-PCR En la página siguiente se muestran las referencias de esta tabla.

85

a _{Los sitos de restricción que han sido adicionadas están subrayados (CTGCAG, PstI; GAATTC, EcoRI).}

b

La posición de los cebadores dentro de la secuencia respectiva de cada gen comenzando a numerar desde el primer codón. (Shimizu, T. et al., 2002).

c

GUS, construcción del plásmido para el ensayo de la -glucuronidasa (Sección 3.5.1.); PM, construcción del plásmido matador (Sección 3.16.); SONDA, construcción de ADN sonda para el análisis por Southern blot (Sección 3.16.1); COMP, construcción del plásmido complementante (Sección 3.5.2.); PCR (amplificación por reacción en cadena de la polimerasa), chequeo construcción mutante KO13 (Sección 3.16.); RT-PCR (trasncripción reversa y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa), determinación niveles de ARNms (Sección 3.15.2.).

3.17. Análisis de secuencias genómicas para determinar la presencia de