Construcción de una cepa de M smegmatis mutante en fasR, utilizando el plásmido termosensible pPR

Mediante experimentos combinados de mutagénesis de alta densidad y análisis por secuenciación masiva se ha postulado que fasR sería un gen esencial en M. tuberculosis [172]. Este método se basa en la construcción de una biblioteca de mutantes por transposición de M. tuberculosis H37Rv, de manera tal que cada cepa que sobrevive a la mutagénesis contenga sólo una única copia del transposón integrada en su genoma. Mediante amplificación por PCR y secuenciación, se identifican los genes cuya mutación no resulta perjudicial para la viabilidad celular. Los genes que caen fuera de este grupo y no presentan inserciones en su secuencia se clasifican, por defecto, como esenciales. Como consecuencia, los resultados obtenidos a partir de este tipo de análisis son solamente orientativos y resulta necesario realizar experimentos de mutagénesis dirigida para determinar si un gen en particular es esencial o no para la viabilidad de un microorganismo. Por otro lado, resulta importante destacar que la mayoría de los reguladores de la biosíntesis de ácidos grasos descriptos hasta el momento en bacteria no son esenciales para su viabilidad [103, 106, 173]. La única excepción es MabR, una proteína involucrada en la regulación de la biosíntesis de ácidos micólicos en micobacterias [109].

En función de lo descripto anteriormente, para confirmar la esencialidad de fasR en la viabilidad de Mycobacterium nos propusimos mutar este gen en M. smegmatis utilizando una estrategia de recombinación homóloga en dos pasos [134]. Para el primer evento de recombinación, el vector termosensible (ts) pFR13, derivado del pPR27 que contiene una copia del gen fasR interrumpida por un cassette de higromicina (fasR::hyg), se utilizó para transformar una cepa salvaje de M. smegmatis mc2155 por electroporación. Una de las colonias transformantes resistentes a higromicina (Hyg) fue crecida a la temperatura permisiva de 30 °C y plaqueada a la temperatura restrictiva de 42 °C para seleccionar un primer evento de recombinación. En estas condiciones, donde el plásmido pFR13 no puede replicar, se espera que las colonias resistentes a Hyg se originen por integración del mismo en el genoma, mediada por un evento de recombinación homóloga. Además, la integración del

105 plásmido también aporta el gen xylE, el cual codifica para la enzima catecol 2,3- dioxigenasa y confiere a la bacteria la capacidad de oxidar el compuesto catecol dando una coloración amarilla a las colonias. Las colonias Hygr, XylE+ se chequearon mediante southern blot (Fig. 27) y se seleccionó aquella que presentaba un evento de recombinación legítimo en la copia cromosomal de fasR. Para seleccionar el intercambio alélico intra-cromosomal, la colonia de M. smegmatis con la correcta integración de pFR13 (MS SCO) se creció en 7H9 a 37 °C y se plaqueó en LB-Hyg- Sacarosa a 42 °C [134]. En este caso, se espera que la recombinación de lugar al reemplazo de la copia salvaje del gen por aquella interrumpida por el cassette de Hyg, perdiéndose de esta manera casi la totalidad del vector pFR13. Dado que el mismo presenta una copia del gen sacB, que confiere sensibilidad a Sacarosa, las bacterias que hayan cursado una recombinación homóloga y perdido consecuentemente el plásmido, podrán crecer en medios suplementados con Sacarosa. Sin embargo ninguna de las colonias analizadas presentaron el fenotipo esperado (Hygr, Sacarosar, blanca tras rociar con catecol) dando indicio de que el reemplazo alélico no era posible y sugiriendo de este modo que fasR sería un gen esencial en M. smegmatis. En consecuencia, para poder obtener el segundo evento de recombinación construimos una cepa merodiploide transformando la cepa MS SCO con el vector pFR5 (vector integrativo con fasRMT bajo control del promotor inducible por acetamida, Pami). La

cepa transformante Kmr Hygr (MS SCO pFR5) se creció a 37 °C en 7H9-Hyg-Km y se plaqueó en LB-Hyg-Km-Sacarosa a 42 °C. Un 80% del total de las colonias recuperadas en estas condiciones resultaron blancas tras rociar con catecol, indicando que el segundo evento de recombinación había ocurrido satisfactoriamente dando lugar al intercambio alélico intra-cromosomal fasR/fasR::hyg en la cepa MSfasR pFR5. Utilizando ADN genómico extraído a partir de tres de estas colonias confirmamos mediante southern blot el correcto reemplazo alélico en el locus fasR (Fig. 27). Estos experimentos confirmaron que fasR sería un gen esencial en M. smegmatis y sugieren fuertemente que FasRMT y FasRMS tienen funciones similares en M. tuberculosis y M.

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Figura 27. Obtención de una mutante condicional de fasR en M. smegmatis. Organización genética, mapa de restricción parcial y perfiles de hibridación esperados de la región cromosómica de fasRMS en A.

una cepa salvaje M. smegmatis mc2155, B-C. los dos posibles eventos de recombinación para una cepa MS SCO y D. una cepa de M. smegmatis mutante por deleción en el gen fasRMS. E. Southern blot de las

distintas cepas de M. smegmatis. El ADN cromosomal se digirió con PstI y se analizó por hibridación con una sonda marcada de 950 pb correspondiente a la región 3’ del gen fasRMS (indicada con una barra).

Calles: 1, cepa salvaje de M. smegmatis mc2155; 2, cepa con un primer evento de recombinación ilegítimo; 3, MS SCO pFR5, con la organización genética que se muestra en C; 4-6, MSfasR pFR5 (se muestran tres clones diferentes DCO1, DCO2 y DCO3, respectivamente).

107 La cantidad de herramientas genéticas disponibles para el desarrollo de mutantes condicionales en Mycobacterium es escasa y la mayoría no permite un control estricto de la expresión del gen en estudio. Dado que nuestro trabajo se centra en el estudio de reguladores transcripcionales, los cuales ejercen su función celular a concentraciones relativamente bajas en comparación con las demás proteínas bacterianas, resulta importante determinar si los niveles de expresión de fasR en la mutante condicional MSfasR pFR5, en ausencia del inductor, son menores a los encontrados en una cepa de M. smegmatis salvaje. Para ello crecimos la cepa mutante a 37 °C en diferentes medios de cultivo: LB, 7H9 o Sauton, en presencia o ausencia de acetamida 0.2% agregada al momento de la inoculación. En paralelo, se creció la cepa de M. smegmatis mc2155, a 37 °C y 42 °C, en medio 7H9. En fase exponencial temprana se tomaron muestras de cada cultivo a partir de las cuales se prepararon extractos proteicos libres de células. Los mismos se analizaron por western blot utilizando anticuerpos anti-FasRMT obtenidos en conejos en nuestro laboratorio e

igualando el contenido sembrado por calle en función de la concentración de los extractos proteicos. En primer lugar y como se observa en la figura 28, confirmamos que la proteína FasRMS no se expresa en la mutante condicional, evidenciándose

únicamente su ortólogo FasRMT de mayor peso molecular, el cual se sintetiza a partir

del plásmido utilizado en la complementación. Por otro lado, si bien en presencia del inductor acetamida se evidencia un aumento considerable de los niveles de síntesis de FasR a partir del promotor Pami, en ausencia del mismo el regulador se está expresando y sus niveles resultarían ser comparables a los hallados en una cepa de M. smegmatis salvaje. En consecuencia, la mutante condicional MSfasR pFR5 no resulta apropiada para el estudio del rol fisiológico de FasR, lo que nos llevó a utilizar un sistema que ofrezca un mejor control de la expresión del gen en estudio.

3.3.2.2 Construcción de una cepa de M. smegmatis mutante condicional en