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BL21  (DE3) codón plus

2.6 Manipulación de ARN

2.6.1 Extracción de ARN de Mycobacterium

El ARN se extrajó a partir de cultivos de M. smegmatis o M. tuberculosis H37Rv en fase exponencial media utilizando el sistema SV total RNA isolation system (Promega) y cuando fue necesario, se trató con la enzima DNasa RQ1 libre de RNasa (Promega), en ambos casos siguiendo las indicaciones del fabricante. La calidad (pureza e integridad) del ARN obtenido se analizó mediante determinación de la relación DO260/DO280 y DO260/DO230, y por electroforesis en geles de agarosa 1% (p/v)

teñidos con GelGreen™ (Biotium) con posterior visualización en un transiluminador con luz azul (excitación a 488 nm).

2.6.2 Retrotranscripción y amplificación por PCR (RT-PCR)

Para determinar si fas y acpS forman un operón en micobacterias, el ARN extraído a partir de cultivos de M. smegmatis mc2155y M. tuberculosis H37Rv en fase exponencial media fue utilizado como molde para la síntesis de ADNc, usando la transcriptasa reversa SuperScript III (Invitrogen), según las especificaciones del fabricante, y hexanucleótidos degenerados como cebadores de la reacción. La amplificación por PCR de las regiones intergénicas se realizó sobre el ADNc sintetizado utilizando oligonucleótidos específicos sobre fas y acpS (Para fasMS-acpSMS =

oligonucleótidos F-MS acpS-fas 5’-CTCGGCGAGAACGATCAGTA-3’ y R-MS acpS-fas 5’- GCCTTGATCACGGCTTCCTT-3’; Para fasMT-acpSMT = oligonucleótidos F-TB acpS-fas 5’-

CGAGGCGTATATCGGCTGAC-3’ y R-TB acpS-fas 5’-CGGCGAAATCGGGAATGGAG-3’).

2.6.3 Determinación del sitio de inicio de la transcripción

El método utilizado para el mapeo del sitio de inicio de la transcripción (TSS) en Mycobacterium depende fuertemente del análisis de los productos de amplificación por PCR obtenidos a partir de muestras de ADNc sintetizados utilizando como molde ARN tratados o no con la pirofosfatasa ácida del tabaco (TAP). Para mapear el TSS del gen fas de Mycobacterium, usamos el kit GeneRacer™ (Invitrogen) siguiendo las especificaciones del fabricante con algunas diferencias. Las muestras de ARN no se trataron con la fosfatasa alcalina (CIP), sino que el protocolo se inició directamente con la remoción del pirofosfato con TAP. Se trabajó por duplicado con muestras de ARN

66 tratadas o no tratadas con TAP para convertir el trifosfato 5’ a monofosfato. Posteriormente, un oligonucleótido de ARN de secuencia conocida se ligó al monofosfato en los extremos 5’ de los ARNs y los mismos fueron utilizados como molde para la síntesis del ADNc utilizando hexanucleótidos degenerados como cebadores de la reacción y la transcriptasa reversa SuperScript III (Invitrogen). A la transcripción reversa le siguieron dos rondas de amplificación por PCR de los ADNc resultantes, en los cuales se utilizaron un oligonucleótido de anclaje y dos juegos de oligonucleótidos específicos: la primera PCR se realizó utilizando los oligonucleótidos específicos RACE-GSP fasI 5’-ACTCGATACCGGCCGAGGACACCAG-3’ para 5’fasMS y RACE

fas MT 5’-CACCGAATGCGACAGCGTAGGG-3’ para 5’fasMT; y la segunda PCR anidada se

realizó usando un oligonucleótido específico interno en cada caso (RACE-GSP fasI nested 5’-GGTCAGATCCGGACTCGTCGTT-3’ para 5’fasMS; RACE fas MT nested 5’-

TGAGGCGATCGACCAGAGCGTG-3’ para 5’fasMT). Los productos de PCR resultantes se

clonaron en el vector pCR BluntII TOPO (Invitrogen) y se determinó la secuencia de ADN a partir de varios clones. Cualquier producto de amplificación obtenido a partir de las muestras tratadas con TAP y ausente en las muestras no tratadas, correspondería a un ARNm completo con un trifosfato en su extremo 5’, indicando que el oligonucleótido de ARN se ligó a un punto de inicio de la transcripción verdadero. Se consideró como TSS el primer nucleótido que le sigue al adaptador 5’-RACE.

2.6.4 PCR en tiempo real (qRT-PCR)

El nivel de expresión de los genes fasRMS, fasMS, acpSMS y kasAMS se determinó

tras la normalización de los correspondientes niveles de ARN a la expresión del gen sigAMS. Un cultivo saturado de la cepa MSPptr:fasRMS crecida en medio 7H9

suplementado con estreptomicina y apramicina fue diluido 200 veces en el mismo medio e incubado por aproximadamente 40 h a 42 °C (DO600∼0.25). Posteriormente, el

cultivo se dividió en dos fracciones iguales y una de ellas se suplementó con ATc 200 ng ml−1. Tras la incubación de ambos cultivos a 42 °C durante 9 h, se extrajo el ARN de cada uno de ellos. El ADNc fue sintetizado utilizando la transcriptasa reversa SuperScript III (Invitrogen) y hexanucleótidos degenerados, y posteriormente fue utilizado como molde para la amplificación por qRT-PCR usando una mezcla de reacción concentrada comercial la cual utiliza fluorocromo verde como colorante

67 indicador (qPCR Mezcla Real, Biodynamics). Para la amplificación por qRT-PCR se utilizó el equipo Mastercycler® ep realplex de Eppendorf, siguiendo las siguientes condiciones: 95 °C por 2 min seguida de 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 58 °C por 15 s y 68 °C por 20 s. Los datos de qRT-PCR se presentan como la diferencia de expresión relativa en la cepa MSPptr:fasRMS con ATc 200 ng ml−1 respecto a la misma cepa sin

ATc, usando el método de Pfafll [151]. El gen sigAMS se utilizó como gen normalizador.

En la Tabla 7 se indican los oligonucleótidos utilizados para la amplificación de cada uno de los genes por qRT-PCR.

Tabla 7.Oligonucleótidos utilizados en los ensayos de qRT-PCR.

Nombre Secuencia (5´-3´) L-sigA CCAAGGGCTACAAGTTCTCG R-sigA TGGATCTCCAGCACCTTCTC L-fasR AGGCGTTCTTCGATTTCATC R-fasR ATCAGATCGAACACGGCATC L-fas CGATGCAGACCATGTACCAC R-fas CCCACATACGACTGCATGAC L-acpS GTCGAGCTCTCGGTTCTCC R-acpS GTCACGTCCTCCAGGTGTTT L-KasA CCGACGCTGAACTACGAGAC R-KasA AACCCGAACGAGTTGTTGAT 2.7 Análisis de lípidos

2.7.1 Análisis de lípidos por cromatografía en capa delgada (TLC)

La biosíntesis de ácidos grasos y ácidos micólicos se analizó por incorporación de [14C] acetato. Se marcaron 5 ml de cada cultivo durante 1 h con [14C] acetato (59 mCi mmol−1) (New England Nuclear) a una concentración de 1 Ci ml−1. Los metil ésteres de ácidos grasos (FAMEs) y ácidos micólicos (MAMEs) se extrajeron siguiendo el protocolo reportado previamente [37]. Las células marcadas se recuperaron por centrifugación y se sometieron a hidrólisis alcalina en 2 ml de hidróxido de terbutilamonio (TBHA) 12% (v/v) a 95 °C durante toda la noche. Posteriormente, se adicionó a la mezcla de reacción 2 ml de diclorometano y 100 l de yoduro de metilo, y se agitó en agitador rotatorio durante 1 h. Las fases se separaron por centrifugación

68 (1000 g, 10 min), y la fase orgánica inferior se lavó con 2 ml de agua y se evaporó hasta sequedad a 55 °C. Los metil ésteres se disolvieron en 2 ml de éter etílico. El éter se traspasó a un nuevo contenedor y se evaporó nuevamente hasta sequedad. El residuo final se disolvió en 200 l de diclorometano, y 10 l de la solución resultante de FAMEs y MAMEs fue utilizada para medir radioactividad en un contador de centelleo Beckman. A su vez, la mezcla se sometió a TLC utilizando una placa de silica gel (5735 silica gel 60 F254; Merck) normalizando la siembra por densidad óptica o número de cuentas. Las placas se corrieron en una mezcla de hexano:etil-acetato (9:1 v/v). Los autoradiogramas se obtuvieron por exposición de los cromatogramas a placas Kodak X- Omat AR, durante toda la noche.