EFFECT OF IGF-I ON FOWL´S AND PORCINE OVARIAN FUNCTIONS AND ITS POSSIBLE MEDIATORS
Kolesárová, A.1, Sirotkin, A2, Capcarová, M.1, Massányi, P.1, Lukáč, N.1, Kováčik, J.1 1
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, 2Ústav genetiky a reprodukcie HZ, Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu v Nitre
Abstract
The aim of our experiments was to study the influence of insulin-like factor I (IGF-I) on release of progesterone (P) and expression of protein kinase A (PKA), tyrosine kinase (TK), MAP kinase (MAPK), transcription factor (CREB), proliferation-associated (PCNA), apoptotic (Bax) and antiapoptotic (Bcl) peptides in the large and small ovarian follicles of domestic fowl and gilts. It was observed that IGF-I stimulated production of P and accumulation of MAPK, PCNA, Bcl in both species. Furthermore, IGF-I stimulated expression of PKA, TK and apoptotic peptide Bax. In gilts but not in fowl, IGF-I suppressed of CREB. The large follicles had significantly higher responses to IGF-I treatment than the small follicles. These data demonstrate the involvement of IGF-I in regulation of proliferation, apoptosis, steroidogenesis, some protein kinases and transcription factor in fowl’s and porcine ovaries.
Úvod
Rastové faktory sa významne podieľajú na vývoji folikulov, oocytovom zrení a ovulácii (Yoshimura, 1998). Inzulínu podobný rastový faktor typu I ( IGF-I) stimulačne pôsobí na rast buniek v rozsiahlom pásme tkanív (Benbassat et al., 1999), reguluje proliferáciu, diferenciáciu a sekrečnú aktivitu buniek vaječníkov (Spicer a Echternkamp, 1995; Armstrong et al., 2000). Efekty IGF-I na proliferačné a generačné funkcie vaječníkov môžu byť sprostredkované cAMP/ proteínkinázami A (PKA), aktivovanými MAP-kinázami (MAPK) a tyrozínkinázami (TK) (Leung a Steele, 1992; Cameron et al., 1996). Či existujú medzidruhové rozdiely v účinkoch IGF-I na vaječníky, nie je celkom známe. Cieľom našich experimentov bolo porovnať účinok IGF-I na proliferáciu, apoptózu a steroidogenézu ovariálnych buniek u hydiny a ošípaných, navrhnúť možné vnútrobunkové mechanizmy účinku IGF-I a zistiť zmeny odozvy buniek na IGF-I počas folikulogenézy. Konkrétne sme sledovali vplyv IGF-I na produkciu steroidného hormónu (progesterónu), na expresiu PKA, TK, MAPK, transkripčného faktoru (CREB), proliferačného peptidu (PCNA), apoptotického (Bax) a antiapoptotického peptidu (Bcl).
Materiál a metódy
Vaječníky sliepok (Leghornka biela) a ošípaných (Biela ušľachtilá) sme vizuálne hodnotili a rozdelili podľa príslušného druhu a veľkosti folikulov. V prípade hydiny sme izolovali a následne kultivovali fragmenty veľkých a malých ovariálnych folikulov (F2 a F12) a u ošípaných ovariálne granulózne bunky metódou aspirácie z malých (2 mm) a stredne veľkých (5 mm) folikulov. Kultiváciu buniek sme uskutočnili bez prídavkov (kontrola) a s prídavkami IGF-I (10 ng/ml) (Sigma, St. Louis, USA). V inkubačnom médiu sme stanovili koncentrácie progesterónu (P) použitím komerčných súprav RIA firmy DSL (Webster, USA) podľa návodu výrobcu. Metódou Western blotting (Laemmli, 1970) a imunocytochemickou analýzou podľa Osborna a Isenberga (1994) pomocou protilátok od firmy Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, USA) sme v kultivovaných bunkách identifikovali PKA, TK,
MAPK, CREB, PCNA, Bax a Bcl. Výsledky boli spracované bežnými štatistickými metódami. Signifikantnosť rozdielov medzi skupinami bola určená testami Wilkoxona a χ2.
Výsledky a diskusia
Zistili sme, že fragmenty ovariálnych folikulov sliepok a granulózne ovariálne bunky prasničiek sú schopné produkovať P, ktorého koncentrácie sa zvyšovali s následným rastom folikulov. Zaznamenali sme aj vplyv prídavku IGF-I na sekréciu P. Podobne ako v prípade sliepok, aj u prasničiek IGF-I stimuloval produkciu P. Stimulačný efekt IGF-I u oboch druhov sa prejavil aj v akumulácii PCNA, Bax a Bcl. Odlišný charakter vplyvu príslušných dávok IGF-I sme evidovali v expresii PKA, TK, CREB a Bax: IGF-I stimuloval expresiu PKA, TK a Bax u sliepok, u ošípaných bol zistený inhibičný vplyv IGF-I na tieto látky. Čo sa týka odozvy IGF-I na akumuláciu transkripčného faktora CREB, u hydiny nebol zaznamenaný účinok na rozdiel od prasničiek, u ktorých sa IGF-I správal ako inhibítor. Účinok IGF-I na vybrané látky bol variabilný nielen v závislosti od hospodárskych druhov, ale aj od veľkosti folikulov. U veľkých ovariálnych folikulov sme evidovali signifikantne vyššiu odozvu IGF-I ako u malých folikulov aj u sliepok a prasničiek.
Výsledky svedčia o vplyve a úlohe IGF-I v regulácii funkcií ovariálnych buniek (proliferácie, apoptózy a steroidogenézy), čo je v súlade s predchádzajúcimi autormi (Spicer a Echternkamp, 1995; Yoshimura, 1998; Benbassat et al., 1999; Armstrong et al., 2000). Zároveň naše pozorovania svedčia o tom, že PKA, TK, MAPK a CREB môžu byť vnútrobunkovými sprostredkovateľmi účinku IGF-I na ovariálne bunky sliepok a ošípaných. Predpoklady, že účinky IGF-I medzi rôznymi druhmi sú podobné, sa potvrdili v prípade P, MAPK, PCNA a Bcl. V prípade PKA, TK, CREB a Bax sme zaznamenali odlišnosti medzi sliepkami a ošípanými, čo svedčí o možných druhových rozdieloch v mechanizmoch účinku IGF-I na ováriá.
Záver
Pozorovania demonštrujú úlohu IGF-I a vnútrobunkových sprostredkovateľov jeho účinku v regulácii ovariálnych funkcií hydiny a ošípaných. Naše pozorovania vysvetľujú principiálnu možnosť využitia IGF-I a iných regulátorov vnútrobunkových signálových dráh v regulácii reprodukcie hospodárskych zvierat.
Literatúra
1. Armstrong, D.G. - Gutierrez, C.G. - Baxter, G. - Glazyrin, A.L. - Mann, G.E. – Woad, K.J. - Hogg, C.O. - Webb, R.: Expression of mRNA encoding IGF-I, IGF-II and type 1 IGF-receptor in bovine ovarian follicles. In: Journal of Endocrinology, roč. 165, 2000,
č. 1, s. 101-113.
2. Benbassat, C. - Shoba, L.N.N. – Newman, M. - Adamo, M.L. - Frank, S.J. - Lowe, W.L.: Growth Hormone – Mediated Regulation of Insulin-Like Growth Factor I Promoter Activity in C 6 Glioma Cells. In: Endocrinology, roč. 140, 1999, č. 7, s. 3073-3081.
3. Cameron, M.R. - Foster, J.S. - Bukovský, A. - Wimalasena, J.: Activation of mitogen-activated protein kinase by gonadotropins and cyclic adenosine 5-monophosphates in porcine granulosa cells. In: Biology of Reproduction, roč. 55, 1996, s. 111-119.
4. Laemmli, U.K.: Cleavage and structure of proteis during the assembly of the head of bacteriophage T4. In: Nature, roč. 277, 1970, s. 680-685.
5. Leung, P.C.K. - Steele, G.L.: Intracellular signaling in the gonads. In: Endocrine Reviews, roč. 13, 1992, s. 476-498.
6. Osborn, M. – Isenberg, S.: Immunocytochemistry of frozen and of paraffin tissue sections. In: Cell Biology, roč. 2, 1994, s. 361-367.
7. Spicer, L.J. - Echternkamp, S.E.: The ovarian insulin and insulin-like growth factor system with an emphasis on domestic animals. In: Domestic Animal Endocrinology, roč. 12, 1995, s. 223-245.
8. Yoshimura, Y.: Insulin-like growth factors and ovarian physiology. In: Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, roč. 24, 1998, č. 5, s. 305-323.
SLEDOVANIE VPLYVU SELÉNU NA ELIMINÁCIU KADMIA Z ORGANIZMU