EFFECT OF SELENIUM ON THE PROTEIN SYNTHESIS IN THE PEA ROOT TIPS
Jomová, K.1, Morovič, M.2, Hegedősová, A.1, Hegedős, O.3, Tóth, T.4 1
Katedra chémie FPV UKF v Nitre,2Katedra botaniky a genetiky FPV UKF v Nitre,
3
Regionálny úrad verejného zdravotníctva, Nitra, 4Katedra chémie FBP SPU v Nitre
Abstract
In our work we analyzed the effect of different concentrations of selenium on the germination of Pisum sativum L. and on the changes in the protein fraction extracted from root tips. The seeds were germinated in the inert substrate in the Petri dishes with the selenium concentration 1, 2, 4 and 6 mg.kg-1 added as a natrium selenate solution. The effect on the germination has been observed gradually with the increasing selenium concentration, the most evidently at higher selenium amount. Root tips were homogenized in Tris-HCl pH 7,5 and protein concentrations was estimated in the clear supernatant obtained after centrifugation at 15 000 rpm. Supernatant samples were mixed with equal volumes of solubilization buffer Tris-HCl pH 6,8 in presence of glycerol, 2-mercaptoetanol and bromphenol blue. After heating at 100 ºC samples were loaded into discontinuous sodium dodecyl sulphate PAGE system using 4% acrylamide stacking gel and 16 % acrylamide separating gel. Electrophoresis was accomplished at 30 mA and proteins were stained by Coomassie Brilliant Blue R-250. In the electrophoretic profiles there have not been observed the qualitative protein changes in comparison with non-treated control variant, but only quantitative changes detected in the gel as a more intensive bands. These changes have been observed at the higher selenium concentrations – 4 and 6 mg.kg-1. Our results showed that the higher selenium concentration does not block the protein production, but it increases the synthesis of constitutive proteins, that are also synthesized in the absence of stress conditions. Both the germination decreasing and increased protein synthesis in the two last variants indicate the potential phytotoxic effect of higher selenium concentration.
Úvod
Selén je stopový prvok dôležitý pre výživu človeka. Hoci bol v minulosti považovaný za toxický, výsledky súčasného výskumu naznačujú jeho pozitívny účinok v prevencii srdcovo-cievnych a nádorových ochorení (Combs, 1997). Z toho dôvodu by mal byť zastúpený v ľudskej potrave ako zložka normálneho nutričného príjmu. Obsah selénu v potravinových produktoch závisí od jeho obsahu v pôde, na ktorej sú poľnohospodárske plodiny pestované (Hu, 2002). Ľudia žijúci v oblastiach s nízkym obsahom selénu v pôdach majú aj nízky príjem selénu (Conor, 1998). Je preto potrebné nájsť spôsob, ako doplniť výživu o tento dôležitý stopový prvok. Riešenie problému pridávaním anorganických zlúčenín selénu (selénan sodný, seleničitan sodný) do živočíšnych krmovín je menej efektívne, nakoľko anorganická forma selénu nie je tak bioprístupná ako organická forma. V súčasnosti je výskum orientovaný skôr na rastliny. Selén sa môže dostať do rastlín buď z pôdy po predchádzajúcej fertilizácii pôdy anorganickými zlúčeninami selénu alebo organickým hnojivom obohateným o selén, prípadne priamou aplikáciou anorganických zlúčenín formou sprejovania listov (Hu et al., 2002). V rastlinných bunkách je anorganický selén metabolizovaný do organicky viazanej formy, ktorý je efektívnejší a bezpečnejší než výživový doplnok anorganického selénu.
Okrem sledovania obsahu selénu prijatého rastlinou pestovanou na pôdach obohatených selénom je dôležité aj sledovanie reakcie rastlín na bunkovej úrovni. Napriek tomu, že selén je súčasťou enzýmu glutationperoxidázy, ktorý sa podieľa na rozklade lipoperoxidov vzniknutých
ako dôsledok oxidačného stresu a pôsobí synergicky s vitamínom E (Miko, 1994), je opodstatnené predpokladať, že aj vysoké koncentrácie selénu, ktoré sú pre rastlinu neprirodzené, môžu pôsobiť ako stresový faktor a vyvolať u rastlín stres. Jednou z odpovedí rastlín na stres je aj zmenená syntéza bielkovín.
Cieľom našej práce bolo sledovať v laboratórnych podmienkach vplyv rôznych koncentrácií selénu na klíčenie semien hrachu záhradného (Pisum sativum L.) a prípadné kvalitatívne a kvantitatívne zmeny frakcie bielkovín izolovanej z koreňových vrcholov naklíčených semien.
Materiál a metodika
Semená hrachu záhradného (Pisum sativum L.) použité v pokusoch boli nakličované v Petriho miskách v inertnom substráte (morskom piesku). V pestovateľskom substráte bolo realizovaných celkovo 5 variantov – s vodou (kontrola) a s roztokmi selénanu sodného s obsahom selénu 1, 2, 4 a 6 mg.kg-1 substrátu. Po 48 hodinách klíčenia boli koreňové vrcholy zvážené a homogenizované v tekutom dusíku. Na extrakciu bielkovín bol použitý roztok 0,05
mol.dm-3 Tris-HCl pH 7,5. Po odstredení homogenátu pri 15 000 ot./min. bola
v supernatante stanovená celková koncentrácia bielkovín (Bradford, 1976).
Na delenie bielkovín bola použitá vertikálna diskontinuálna SDS-PAGE podľa ISTA (Wrigley, 1992) s počiatočnou koncentráciou polyakrylamidu 4 % v štartovacom géli a 16 % v deliacom géli. Ku vzorke bol pred nanesením do gélu pridaný pracovný roztok (1 mol.dm-3 Tris-HCl pH 6,8, 2-merkaptoetanol, 10% SDS, 19% glycerol, pyronín G). Vzorka bola denaturovaná teplotou 95 ºC po dobu 4 min.. Elektroforetické delenie prebiehalo na zariadení Mini Protean 3. Elektroforeogramy boli vyhodnotené denzitometricky pomocou programu Quantity One (Bio-Rad).
Výsledky
V experimentoch zameraných na sledovanie vplyvu vyšších koncentrácií selénu na klíčenie, prípadne na možné bielkovinové zmeny v koreňových vrcholoch hrachu záhradného, bol použitý inertný substrát, ktorý neobsahoval žiadne zložky prijateľné rastlinami, s cieľom vylúčiť iný vplyv na vývoj rastlín. V porovnaní s kontrolným variantom, so zvyšujúcou sa koncentráciou obsahu selénu sa postupne klíčivosť znižovala, výraznejšie vo variantoch 4 a 5. V piatom variante so 6 mg selénu na kg substrátu bolo klíčenie najslabšie a rast výrazne oneskorený, čo naznačuje možný fytotoxický účinok vyšších koncentrácií selénu.
V elektroforetických profiloch neboli zistené kvalitatívne zmeny bielkovín v porovnaní s kontrolou, iba zmeny v intenzite bielkovinových pásov (Obr.1-2).
Obr. 1 Elektroforetický profil bielkovín z koreňov hrachu po aplikácii selénanu sodného (a/b: a = „0“ - kontrolný variant, 1,2,4,6 – koncentrácie selénanu sodného, b = označenie opakovania).
V spektre bielkovín sú pozorovateľné tieto zmeny od koncentrácie selénu 2 mg.kg-1, hoci intenzívnejšie bielkovinové pásy boli detegované až pri koncentráciách selénu 4 a 6 mg.kg-1. Zvýšená syntéza niektorých bielkovín je pravdepodobne spojená s obrannou reakciou rastliny voči stresu vyvolaného vysokými koncentráciami selénu. Výsledky pozorované v elektroforetických profiloch bielkovín sú v súlade s pozorovaniami z klíčenia. Pri najvyšších koncentráciách selénu (4 a 6 mg.kg-1), kde bolo klíčenie najslabšie, boli aj najvyššie koncentrácie sledovanej frakcie bielkovín.
Obr.2 Denzitometrické vyhodnotenie elektroforeogramu.
Diskusia
V experimentoch sme potvrdili zmeny v klíčení semien hrachu záhradného a kvantitatívne bielkovinové zmeny v koreňových vrcholoch tejto plodiny vyvolané rôznymi koncentráciami selénu aplikovaného formou roztokov selénanu sodného. Vplyv vyšších koncentrácií selénu na klíčenie semien a zvýšenú syntézu bielkovín indikuje možný fytotoxický účinok aplikovaných dávok na rastlinu. Naše výsledky ďalej dokumentujú, že vplyvom zvýšených koncentrácií selénu nedochádza k zablokovaniu syntézy bielkovín, ale ku zvýšenej syntéze konštitutívnych bielkovín, ktoré sa v bunke syntetizujú aj za normálnych nestresových podmienok. Poznanie reakcie rastlín na bunkovej úrovni v prítomnosti vyšších koncentrácií selénu môže pomôcť pri optimalizovaní podmienok fertilizácie pôd a tiež výbere plodín vhodných na pestovanie na takto upravených pôdach.
Literatúra
1. BRADFORD, M. M. : A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. In: Analyt. Biochem. 72, 1976, p. 248-254
2. COMBS, J.G.F.: Selenium as a cancer-protective agent. Bulletin of
Selenium-Tellurium Development Association, Grimbergen, Belgium Feb., 1997, p.1-4 3. CONOR, R.: Selenium: A new entrant into the functional food arena. Trends Food Sci,
4. HU, Q. – PAN, G. – ZHU, J.: Effect of fertilization on selenium content of tea and the nutritional function of Se-enriched tea in rats. In: Plant and Soil 238, 2002, p. 91-95 5. MIKO, M.: Mikrominerálie vo výžive V. – Selén. In: Výživa a zdravie, roč. 39, č.4,
1994. s. 63-64
WRIGLER, C.W. : Identification of cereal varieties by gel electrophoresis of the grain proteins. In : H.-F. Linskens, & J.F. Jackson, (eds), Sedd Analysis, 1992, p. 17-41, Springer Verlag, Berlin & Heidelberg, Germany