PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteria causante del cólera. Esta bacteria se adquiere por ingestión de bebidas o alimentos contaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido a la producción de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos. En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, la forma clínica del cólera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a “agua de arroz”) y vómitos. Esto provoca en el paciente deshidratación severa que puede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratación y antibióticos. El cólera ha sido endémico en la India y en otros países desde la más remota antigüedad. En 1961 se inició la séptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991 apareció en Perú y a partir de allí se ha diseminado a varios países de Latinoamérica, donde ahora es una infección endémica, más frecuente durante la época lluviosa.
Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 según su antígeno somático), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima que aún no se ha detectado en Latinoamérica. Generalmente si la epidemia se inicia con el serotipo Inaba, después de algún tiempo se transforma en Ogawa, debido a cambio de antígenos. Esta clasificación sólo tiene interés epidemiológico. Existen dos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clásico. En Latinoamérica, durante la presente pandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemias con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o asintomáticos; también sobrevive más tiempo en el medio ambiente, y es más re- sistente a los agentes químicos.
El tratamiento principal del cólera es evitar la muerte por deshidratación, por medio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por vía oral y si es necesario por vía intravenosa. El tratamiento con antibióticos ayuda a la recupe- ración, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, además evita portadores de la bacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en niños el trimetoprim- sulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica la furazolidona.
El diagnóstico definitivo de cólera se establece sólo por la demostración de V. cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indi- cativo de cólera, pero no se considera un procedimiento diagnóstico exacto. MUESTRA:
Las muestras adecuadas para efectuar el diagnóstico bacteriológico de el có- lera son: heces diarréicas (principalmente con apariencia de “agua de arroz”), hisopo rectal o vómitos. Deben recolectarse de preferencia dentro de las primeras 24 horas de la enfermedad y previo a la administración de antibióticos. Si las muestras de heces frescas van a ser procesadas en un tiempo adecuado (antes de dos horas), deben recolectarse en un recipiente de vidrio o plástico bien limpio, de preferencia estéril, y enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso contrario deben inocu- larse dos hisopos con material fecal en el medio de transporte Cary-Blair, que debe enviarse al laboratorio de referencia sin necesidad de refrigeración. En el medio hospitalario no es necesario usar inútilmente el medio de transporte Cary-Blair, ya que la muestra de heces frescas debe remitirse al laboratorio para su cultivo directo inmediato.
PROCEDIMIENTO:
Existen muchas variantes en la marcha bacteriológica a seguir para el aisla- miento e identificación de Vibrio cholerae 01. La marcha simplificada propuesta es, en la experiencia del autor, efectiva y sencilla (ver figura 7, pág. 67). V. cholerae 01 puede aislarse directamente de las heces, pero se logran resultados mucho mejores si previamente se hace un enriquecimiento en el caldo selectivo alcalino llamado agua pepto nada alcalina o APA. En este caldo el agente etiológico del cólera proli- fera en la superficie, pues resiste la alcalinidad extrema del medio (pH 9.0 a 9.2), y otras bacterias de la microbiota fecal se destruyen, por lo que se obtienen cultivos casi puros.
1. Inocular masivamente un tubo con 5 ml de agua peptonada alcalina, con un hisopo estéril bien cargado de heces o vómito. Sacar el hisopo y agitar muy bien el tubo, luego incubar verticalmente y con el tapón lige- ramente suelto, solamente por 5 a 8 horas a 36° C.
2. Si se trata de heces, inocular directamente cajas de agar MacConkey, XLD o SS e idealmente Hektoen para el aislamiento de Shigella y Salmonella, ya que las infecciones intestinales causadas por estos dos géneros, clínicamente pueden semejar cólera.
3. Después del tiempo crítico de incubación del APA, retirar el tubo cuida- dosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo, tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no más de 5 mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar sangre de carnero al 5%. Incubar aeróbicamente 18 a 24 horas a 36° C. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadas concentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad del medio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis de buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventual- mente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinónimo: sucrosa). Contiene dos indicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarillo en presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colo- nias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, también producen colonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importancia epidemiológica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positi- vo, también pueden producir colonias amarillas, pero de morfología distinta a las que produce V. cholerae 01.
1. Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de co- lonias grandes (de 2 a 3 mm de diámetro), de color amarillo canario (sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colo- nias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selecti- vo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria.
2. Si hay crecimiento típico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desa- rrollará un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incolo- ras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolíticas. En el área de la caja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zona de decoloración del medio que semeja hemólisis; probablemente se debe al metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemólisis específica a los eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01 del biotipo eltor; en todo caso, es una característica adicional que ayuda a sospechar la presencia de la bacteria en este medio.
3. Aglutinar las colonias típicas y aisladas del agar sangre de carnero, con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las
colonias pequeñas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las colonias son “chiclosas”, muy adherentes al medio, y no se pueden sus- pender bien en el antisuero, por lo que la aglutinación sólo es confiable a partir del crecimiento en agar sangre de carnero.
4. Si se obtiene una reacción de aglutinación positiva, franca e inmediata, generalmente con presencia de grumos grandes, se ha demostrado la presencia de V. cholerae 01. Proceder a aglutinar el crecimiento típico del agar sangre de carnero en antisueros anti-serotipo Inaba y anti-serotipo Ogawa; generalmente la aglutinación es más fina, pero evidente. Esto último no es crucial, pero si deseable. La prueba de oxidasa es positiva; debe hacerse en caso de duda o confirmación.
5. Si el laboratorio no cuenta con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01, se deberá seleccionar una colonia típica del TCBS, y subcultivar en TSI y LIA. En estos medios la reacción después de 18 a 24 horas de incubación, generalmente es TSI: K/A (A/A); LIA: K/K-N, sin gas ni ácido sulfhídrico en ambos tubos. El tubo de TSI debe remitirse al laboratorio de referencia donde se efectúa la confirmación.
6. Efectuar prueba de susceptibilidad a los antibióticos, según el método de Bauer-Kirby. Sólo deben colocarse los siguientes discos: tetraciclina y trimetoprim-sulfametoxazol, son indispensables; ampicilina o algún otro antibiótico, son optativos. Interpretar los diámetros de los halos de inhi- bición igual que para enterobacterias. Es deseable, pero no indispensa- ble, colocar en el centro de la caja de agar Mueller-Hinton, un disco con 50 UI de polimixina-B. La resistencia con ausencia de zona de inhibición a este antibiótico, indica que la cepa aislada de V. cholerae 01, pertenece al biotipo eltor. Esto es de esperarse en Latinoamérica, ya que el biotipo clásico no está actualmente presente. Si se detecta una cepa susceptible a polimixina-B, debe remitirse al laboratorio nacional de referencia per- tinente, para que confirme este hallazgo de interés nacional. El biotipo eltor presenta una prueba de Voges-Proskauer positiva.