MANUAL PRÁCTICO DE
MANUAL PRÁCTICO DE
MANUAL PRÁCTICO DE
MANUAL PRÁCTICO DE
MANUAL PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
por
por
por
por
por
Miguel F. Torres
Miguel F. Torres
Miguel F. Torres
Miguel F. Torres
Miguel F. Torres
Portada interna:
Microfotografía electrónica de Salmonella typhi en división. Muestra los flagelos, las fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibu-jos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.
© 1996, Miguel Francisco Torres Rubín
Químico Biólogo graduado de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Posee Maestría en Microbiología Médica de la Universidad de Duke, Carolina del Norte, Estados Unidos.
Fundador del Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y catedrático ti-tular de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología, Escuela de Química Biológica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala.
Por muchos años fue microbiólogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social (IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Acade-mia de Ciencias Médicas, Físicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Aca-demia Guatemalteca de Historia de la Medicina.
Los criterios expresados en esta publicación son de la exclusiva responsabilidad del autor e incluyen su experiencia personal.
Impreso en Editorial Serviprensa C.A. 3a. avenida 14-68, zona 1 Tels. 232-5424, 232-9025 Fax: 232-0237
ÍNDICE
PRESENTACIÓN / 11 AGRADECIMIENTOS / 13 PRÓLOGO / 15
Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch. CAPÍTULO 1:
BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA / 21
El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad para el Laboratorio de Microbiología. Medidas de Bioseguridad. Métodos de Esterilización o Desinfección. Descontaminación. Antisepsia. Uso efectivo de Antisépticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilización. Resistencia de Microorganismos a Germicidas Químicos.
CAPÍTULO 2:
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA / 29
Cómo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriología. Fig. 1 Mesa de Trabajo para Bacteriología. La Coloración de Gram. Foto: Hans Gram. Fórmulas: Reactivos para la Coloración de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiológicas y su Uso, 1 Asas para Bacteriología, 2 Asas para Micología y Micobacterias. Fig. 3 Inoculación de Medios Sólidos por Estrías.
CAPÍTULO 3:
COPROCULTIVO / 41
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriológica para Coprocultivo. Interpretación de Resultados. Fig. 5 Observación y Señalamiento de Colonias Sospechosas. Fig. 6 Técnica para tomar Inóculo de Colonias Individuales. Reacciones de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciación de las Especies del Género Shigella. Diferenciación de las Especies del Género Salmonella. Informe. Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Colección de Muestras Duodenales. La Epidemiología y Etiología de la Diarrea. Patógenos Frecuentemente Identificados en Niños con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros de Tratamiento, en Países en Desarrollo.
CAPÍTULO 4:
COPROCULTIVO PARA CÓLERA / 63
Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Fig. 7 Marcha Bacteriológica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Fórmulas: 1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.
CAPÍTULO 5:
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71
Propósito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Informe.
CAPÍTULO 6:
INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori / 75
Propósito. Muestra. Observación Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe. CAPÍTULO 7:
UROCULTIVO / 79
Propósito. Manifestaciones Clínicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre. Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Niños Pequeños. Punción Supra-púbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha Bacteriológica para Urocultivo. Interpretación de Resultados. Informe. Detección de Bacteriuria por la Coloración de Gram de Orina no Centrifugada.
CAPÍTULO 8:
CULTIVO DE GARGANTA / 91
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriológica para Cultivo de Garganta/Exudado Faríngeo. Interpretación. Foto: Interpretación de la Prueba de Bacitracina. Identificación Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretación de la Prueba de CAMP. Características Físicas, Hematológicas y Químicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la Sangre de Carnero en el Laboratorio Clínico.
CAPÍTULO 9:
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105
Propósito. Investigación de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento. Interpretación de Resultados. Informe. Investigación de Neisseria meningitidis en Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretación. Informe.
CAPÍTULO 10:
CULTIVO DE ESPUTO / 121
Propósito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretación del Frote Gram de Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretación de Resultados e Informe. Etiología y Sintomatología de Neumonía y Bronquitis.
CAPÍTULO 11:
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129
Propósito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan el Diagnóstico Bacteriológico. Interpretación de Resultados. Etiología y Sintomatología de Septicemia. Informe.
CAPÍTULO 12:
SECRECIONES DIVERSAS / 137
Propósito. Muestra. 1 Piel. Etiología y Sintomatología de Heridas Infectadas. 2 Ojos. Etiología y Sintomatología de Infección Ocular. 3 Oídos. Etiología y Sintomatología de Otitis Media. 4 Misceláneos. Procedimiento. Interpretación de Resultados e Informe. Principales Pruebas para la Diferenciación de Tres Especies del Género Staphylococcus de Origen Humano.
CAPÍTULO 13:
SECRECIONES GENITALES / 147
Propósito. Diagnóstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus Uretral Masculino. Diferenciación de Dos Especies de Neisseria de Importancia Clínica. Diagnóstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnóstico Directo de la Sífilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos del Tracto Genital Femenino. Introducción. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes Etiológicos.
CAPÍTULO 14:
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163
Propósito. Muestra. Etiología y Sintomatología de Infección Osea y Articulaciones. Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriológica para Líquido Cefalorraquídeo (LCR). Interpretación de Resultados. Informe.
CAPÍTULO 15:
TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171
CAPÍTULO 16:
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177
Propósito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12 Marcha Bacteriológica para Antibiograma. Antibióticos Aprobados (FDA-USA) que deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gram-negativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretación de Resultados. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) para Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Límites Aceptables de los Halos de Inhibición (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas Control. Fuentes Comunes de Error.
CAPÍTULO 17: ANAEROBIOS / 193
Propósito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Características Morfológicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de Importancia Médica. Interpretación del Cultivo. Morfología Microscópica. Fig. 12 Diversas Morfologías Bacterianas. Informe.
CAPÍTULO 18:
MICOBACTERIAS / 203
Propósito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gástrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras. Procedimiento. Procedimiento de la Coloración de Ziehl-Neelsen. Fórmulas: Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloración de Kinyoun. Fórmulas: Reactivos para Kinyoun. Interpretación e Informe de Baciloscopías. Reporte de Frotes para Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestión y Descontaminación de Esputos. Método de Digestión y Descontaminación con N-acetil-levo-cisteína (NALC). Fórmulas. Digestión y Descontaminación de Esputos por el Método Convencional de Hidróxido de Sodio. Fórmulas. Procedimiento de Digestión/ Descontaminación para Esputos de Pacientes cuyas muestras están constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados Gástricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Faríngeo. Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales. Interpretación del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias “Atípicas”).
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34
MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA Fig.2 / 39
CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO 1 Asas para Bacteriología
2 Asas para Micología Fig.3 / 40
INOCULACIÓN DE MEDIOS SÓLIDOS POR ESTRÍAS Fig.4 / 45
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO Fig.5 / 46
OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS Fig.6 / 48
TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES Fig.7 / 67
MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01
Fig.8 / 84
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO Fig.9 / 94
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA FIG.10 / 100
SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP Fig. 11 / 166
Fig.12 / 181
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA Fig.13 / 201
DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS
Nota:
Al centro del libro, a partir de la página 111 aparecen 32 fotografías a color y sus explicaciones correspondientes.
Guatemala, agosto de 1996 P R E S E N T A C I Ó N P R E S E N T A C I Ó N P R E S E N T A C I Ó N P R E S E N T A C I Ó N P R E S E N T A C I Ó N
Las enfermedades infecciosas continúan siendo la principal causa de morbi-mortalidad en Mesoamérica. Entre las variadas infecciones que afectan la salud pública de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de las más frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personal de salud en diagnóstico bacteriológico, incide directamente en su mejor tratamiento y control.
La Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA a la comunidad científica de Guatemala y Centroamérica. Como su título lo indica, se trata de un libro fácil de leer, comprender y aplicar, dirigido a profesionales, estudiantes y técnicos que estudian o trabajan directamente la bacteriología en los laboratorios clínicos privados o estatales.
El autor es catedrático titular desde hace 22 años en el Departamento de Microbiología, Escuela de Química Biológica de esta Casa de Estudios. Durante estos años, ha tenido a su cargo la enseñanza de la bacteriología médica a los estudiantes de Química Biológica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuera de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no sólo como catedrático e investigador a través de sus múltiples publicaciones en revistas científicas nacionales e internacionales, sino también a lo largo de los años ha demostrado su empeño por mejorar la microbiología en nuestro medio. Uno de sus principales logros fue la creación del Laboratorio Microbiológico de Referencia -LAMIR- en 1991.
La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigación en bacteriología, parasitología y micología, aunados a sus conocimientos y experiencia adquiridos durante varios años de servicio como microbiólogo clínico del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenido del manual.
Esta obra fue completada por el autor durante su año sabático de la Universidad de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos éxitos.
Atentamente,
Lic. Jorge Rodolfo Pérez Folgar Decano
AGRADECIMIENTOS
El autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados bacteriólogos de Centroamérica y el Caribe, por su valiosa colaboración al haber revisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiosos comentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio, enriquecen la obra.
Licda. Floridalma Cano Granados
Supervisora del Laboratorio de Bacteriología y Parasitología Intestinal Laboratorios de Microbiología “Dr. Leonardo J. Mata”
Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá Guatemala
Dr. Edmundo E. Poujol
Ex-Director del Departamento de Microbiología Universidad Nacional Autónoma
Honduras
Dr. Jaime Guevara R.
Jefe de la Sección de Laboratorios Dirección Técnica de Servicios de Salud Caja Costarricense de Seguro Social Costa Rica
Dra. Marion C. de Martin
Vice-decana de la Facultad de Medicina Universidad Nacional
Panamá
Dr. Gerardo F. Martínez
Jefe del Departamento de Bacteriología / Micología Sub-Dirección de Microbiología
Instituto de Medicina Tropical “Dr. Pedro Kourí” Cuba
A los personeros del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de Guatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias de la Segunda Edición del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestro mensaje académico y guía de trabajo a profesionales, técnicos de laboratorio y estudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriología médica en nuestros países,
PRÓLOGO A LA SEGUNDA EDICIÓN
Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin embargo, la bacteriología médica surgió como tal hacia fines del siglo XIX, con los geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propagó una bacteria patógena en cultivo puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no sólo estableció ésta bacteria como causa del ántrax en el ganado vacuno, sino inauguró un método de investigación de las infecciones, actualmente vigente.
Hoy en día, la bacteriología clínica ha avanzado enormemente y en la última década del siglo XX es muy extensa y diversa. Por este motivo, se hace necesario extraer de la literatura actualizada los conocimientos, técnicas y criterios interpretativos necesarios para efectuar adecuadamente los análisis bacteriológicos más frecuentes, y ordenarlos de manera simple y comprensible. Estos son los propósitos fundamentales de la presente publicación.
Este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA no es un texto exhaustivo de la materia, ni mucho menos un tratado de taxonomía bacteriana. Es una guía simplificada de trabajo, orientada hacia la obtención de resultados lo más rápido posible y con el mayor significado clínico. Al final del libro, se seleccionan las referencias bibliográficas más relevantes.
Anteriormente se aceptaba que el buen bacteriólogo clínico era aquel capaz de identificar hasta especie todas las bacterias presentes en determinado cultivo. Hoy en día este concepto ha cambiado y el buen bacteriólogo clínico es quien discrimina efectivamente los microorganismos potencialmente patógenos de la microbiota normal, los identifica total o presuntivamente lo más pronto posible y emite un informe claro y correcto. Por este motivo, en el presente manual práctico se hace énfasis en los criterios actualizados de interpretación.
El estudio de la Historia de la Humanidad, permite comprender la realidad presente y proyectarse mejor hacia el futuro. En el caso de la bacteriología médica, los inspiradores escritos, sus retratos y el ejemplo de tres pioneros de esta ciencia, que aparecen al principio del libro, van dedicados al amable lector.
Es imperativo hacer mención del gran aporte que el invento del microscopio representó para las ciencias biológicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo XVII fue el primer humano que observó las bacterias. Este personaje longevo, no sólo efectuó grandes descubrimientos con sus microscopios de “lente de gota”, sino también nos legó su ejemplo del valor de la palabra científica escrita. El microscopio compuesto que usamos hoy en día fue inventado posteriormente por los hermanos Hans y Zacarías Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.
Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosa entretención para científicos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas de las cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de la bacteriología, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron los descubrimientos básicos que han permitido el desarrollo de la bacteriología médica moderna. Los logros de estos dos pioneros fueron múltiples, por lo que es muy difícil sumarizarlos. Conviene recordar que el increíble avance de la bacteriología en las postrimerías del siglo XX, y el que vivirán nuestros descendientes en el próximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discípulos. La Primera Edición de este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA, fue patrocinada por la compañía farmacéutica Pfizer, en septiembre de 1996. Esta edición se agotó rápidamente entre profesionales y estudiantes de laboratorio clínico en Centroamérica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptado como referencia del trabajo rutinario en bacteriología clínica en múltiples laboratorios y es libro de texto en varias universidades.
En 1999, el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de Guatemala, ha reconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edición, la cual llegará a todos los profesionales y técnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clínicos, ahora como norma obligatoria a observar en bacteriología médica. El autor ha plasmado en el presente libro, treinta años de experiencia en la materia, de manera simplista y expresando lo mínimo que es necesario efectuar en los laboratorios clínicos de Mesoamérica.
Miguel F. Torres, Q.B., M.A.
El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo, antes de la invención del microscopio, el hombre desconoció la vida microscópica y la estructura celular de los tejidos.
Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda. Fabricó ingeniosos microscopios con pequeños lentes fundidos en placas de diversos metales. Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser humano que observó las bacterias, los protozoos, los glóbulos rojos y los espermatozoides.
Durante 50 años, informó periódicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartas dirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental, dibujó y reportó por primera vez los tres tipos de formas bacterianas.
Carta a sus hermanas:
“La voluntad es algo grande, pues la acción y el trabajo
generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se
acompaña del éxito.
Estas tres cosas, trabajo, voluntad y éxito, llenan la existencia
humana.
La voluntad abre la puerta al éxito, ambos brillantes y felices, el
trabajo pasa estas puertas y al final del viaje el éxito corona nuestros
esfuerzos”.
Roberto Koch fue un médico rural alemán, nacido en 1843. Sus aportes a la
bacteriología médica fueron enormes. Primero cultivó la bacteria causante del ántrax en
humor vítreo de buey. Luego desarrolló gradualmente técnicas bacteriológicas fundamentales,
como el uso del agar extraído de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y
así poder observar colonias.
Con su discípulo Paul Ehrlich, aplicó los colorantes derivados de la anilina a la
coloración de microorganismos. Descubrió las bacterias causantes de el cólera, la
tubercu-losis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueño.
CAPÍTULO 1
BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA
La microbiología es la ciencia que estudia a los seres vivos microscópicos, es decir que sólo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeños orga-nismos microscópicos son llamados vulgarmente “microbios”, pero la palabra co-rrecta para designarlos es microorganismos. La microbiología se aplica no sólo a la ciencia médica, sino también a la veterinaria, a la agronomía y a la industria, por lo que forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias.Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican según su estructura, manera de reproducirse y muchas otras características. Los grupos más importantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y los hongos. Los virus son los microorganismos más pequeños, se reproducen única-mente dentro de las células y tienen forma similar a cristales. La palabra microorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre sí.
La microbiología se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupo taxonómico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos, pero su estudio se basa en estructuras microscópicas.
Bacteriología (bacterias) Micología (hongos) Virología (virus) Parasitología Protozoología (protozoos) Helmintología (helmintos)
Entomología (insectos, ácaros, otros)
La mayoría de los microorganismos no son capaces de causar enfermedades en el hombre y se les llama por esta razón “saprófitos” o “saprobios”. Sin embargo, algunos causan enfermedades en el hombre, llamadas infecciones. Cuando un microorganismo es capaz de producir infección, se dice que es “patógeno”; la “virulencia” es la cuantificación de la patogenicidad.
La inmunología nació ligada a la microbiología como el estudio de los meca-nismos de defensa contra los microorgameca-nismos. Ahora su campo de acción se ha extendido mucho y es una ciencia biológica independiente.
En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las bacterias y los hongos son los más abundantes; prácticamente todos los objetos que vemos y tocamos están cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente don-de hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), está cubierto don-de bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice que forman parte de alguna “microbiota”. Por microbiota se entiende aquel con-junto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin causarle ningún daño. La palabra “flora” no es correcta, y por lo tanto no debe utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas “colonizan”, no infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama “oportunistas”.
EL NOMBRE CORRECTO DE LOS MICROORGANISMOS:
Todos los nombres científicos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran grupo, es el género y siempre se escribe la primera letra con mayúscula. El segundo nombre es la especie y siempre se escribe con letras minúsculas. Casi todos los nombres científicos de los microorganismos se derivan del griego o del latín, por esta razón:
a) Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursiva b) Nunca se tildan
Ejemplos:
Staphylococcus aureus (bacteria) Escherichia coli (bacteria) Streptococcus pyogenes (bacteria) Pseudomonas aeruginosa (bacteria) Entamoeba histolytica (parásito, protozoo) Giardia lamblia (parásito, protozoo) Ascaris lumbricoides (parásito, helminto) Trichophyton rubrum (hongo)
Microsporum canis (hongo)
Además del nombre científico, en algunos casos existe un nombre de uso co-mún o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.
Nombre correcto: Nombre vulgar: Escherichia coli colibacilo (bacteria) Streptococcus pneumoniae neumococo (bacteria) Neisseria gonorrhoeae gonococo (bacteria) Enterobius vermicularis oxiuro (parásito, helminto) Trichuris trichiura tricocéfalo (parásito, helminto) Entamoeba histolytica ameba histolítica (parásito, protozoo) Entamoeba coli ameba coli (parásito, protozoo) Hymenolepis nana tenia nana (parásito, helminto)
Candida albicans monilia (hongo)
Si se desea hacer referencia a todas las especies de un género se usa la abre-viatura para especies: “spp.” y no se subraya. Si sólo se refiere a una especie no determinada de un género dado, se usa: “sp.” abreviatura de especie.
Ejemplos:
Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen. Shigella sp. = una especie no determinada del género Shigella.
RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Dr. Miguel F. Torres y Dra. Margarita Paz de Ramírez
Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y Depto. de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos. Tomado de:
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 11. Lavarse las manos frecuentemente
12. Usar gabacha
13. Usar guantes de caucho en buen estado cuando es necesario 14. Usar mascarilla cuando es necesario
15. Rotular adecuadamente todo el material y los reactivos 16. No comer en el área de trabajo
17. No almacenar comida en el área de trabajo 18. No fumar
19. Usar adecuadamente los desinfectantes
10. Usar detergentes y desinfectantes adecuados para cada tipo de material 11. Clasificar los desechos
12. Descontaminar el material biológico antes de descartarlo 13. Esterilizar o incinerar el material contaminado
14. Destruir el material descartable o no reusable 15. No utilizar materiales inflamables cerca del mechero 16. Conocer el uso y manejo de los extinguidores 17. Neutralizar los desechos químicos
18. Descontaminar el material radioactivo antes de su descarte Equipo necesario:
1. Campana bacteriológica
2. Campana de flujo laminar cuando es necesario 3. Lámpara de pie 4. Mechero o incinerador 5. Incubadora bacteriológica 6. Autoclave 7. Horno esterilizador 8. Agitador de tubos 9. Centrífuga
Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigación: 1. Extinguidores en lugares accesibles
2. Basureros cerrados 3. Lava-ojos
4. Extractor de vapores 5. Incinerador
6. Recipientes con desinfectantes y descontaminantes 7. Campana de flujo laminar y/o de bioseguridad
8. Equipo adecuado para descarte de material contaminado y de solventes 9. Recipientes plomados
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN O DESINFECCIÓN
Método Concentración o nivel Actividad
ESTERILIZACIÓN:
Calor Húmedo (autoclave) 121° C a diferentes intervalos de tiempo Seco (horno) 171° C por 1 hora; 160° C por 2 horas;
121° C por 16 horas
Gas Oxido de etileno 450-500 mg/litro a 55-60° C
Líquido Glutaraldehido variable Peróxido de hidrógeno 6-30% Formaldehido 6-8% Dióxido de cloro variable
DESINFECCIÓN Calor Húmedo
(incluye pasteurización) 75-100° C alta
Líquido glutaraldehido variable alta-media
peróxido de hidrógeno 3-6% alta-media
formaldehido 1-8% alta-media
compuestos clorinados 500-5,000 mg de cloro libre/litro intermedia alcoholes (etanol, isopropílico) 70% intermedia compuestos fenólicos 0.5-3% media-baja compuestos yodados 0.1-0.2% media-baja
ANTISEPSIA
alcoholes 70%
yodóforos 1-2 mg de yodo libre/litro
DESINFECCIÓN:
Proceso generalmente menos letal que la esterilización.
Elimina virtualmente todos los microorganismos patógenos pero no ne-cesariamente todas las formas microbianas (esporas).
El procedimiento de desinfección carece del margen de seguridad que se logra por los procedimientos de esterilización.
Factores:
1. Naturaleza y número de microorganismos contaminantes. 2. El tipo y configuración del material a desinfectar.
3. Tipo y concentración del germicida químico usado. 4. Tiempo y temperatura de exposición.
DESCONTAMINACIÓN:
Es un término usado para describir un proceso o tratamiento aplicado a una superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este término abarca desde lavado con agua y jabón hasta la desinfección o esterilización.
ANTISEPSIA:
Un antiséptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejido vivo con el propósito de inhibir o destruir microorganismos.
USO EFECTIVO DE ANTISÉPTICOS, DESINFECTANTES Y PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN
Factores para la elección de desinfectantes y procedimientos de esterilización.
1. Grado de muerte microbiana requerida.
2. Naturaleza del material o la superficie a ser tratada. 3. Costo y disponibilidad de los agentes germicidas.
ESTERILIZACIÓN:
Uso de procedimiento físico o químico para destruir toda la vida microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianas altamente resistentes.
Tipos de esterilización:
Calor húmedo: autoclave de vapor Calor seco: horno esterilizador Gas de óxido de etileno
Esterilizantes químicos: germicidas basados en glutaraldehido. RESISTENCIA DE MICROORGANISMOS A GERMICIDAS QUIMICOS (*)
ESPORAS BACTERIANAS Bacillus subtilis Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. bovis VIRUS PEQUEÑOS O NO LIPÍDICOS Poliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus
HONGOS
Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp. BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella choleraesuis
VIRUS DE MEDIANO TAMAÑO O LIPÍDICOS Herpes simplex - Cytomegalovirus
Virus sincitial respiratorio Virus de Hepatitis B
Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) (*) En orden descendente de resistencia
CAPÍTULO 2
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA
Las bacterias son microorganismos formados por una sola célula muy sim-ple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentación y reproducción. Son uno de los grupos microbianos más frecuentes y abundantes en casi todos los ambientes.
La reproducción de las bacterias ocurre por simple partición de una célula en dos células hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparación con la repro-ducción de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas que son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser móviles o inmóviles. Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos que agitan en forma de látigo.
Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condicio-nes de laboratorio, debe proporcionárseles todas las sustancias nutritivas que re-quieren (proteínas, azúcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado según cada medio de cultivo.
Las bacterias se clasifican en base a diversas características. Según sus reque-rimientos de oxígeno, las bacterias pueden ser:
a. Aerobias: Crecen bien en la atmósfera que respiramos, es decir en pre-sencia de oxígeno, el cual requieren para su sobrevivencia.
b. Microaerofílicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxí-geno. Para disminuir la concentración de oxígeno en el microambiente en el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos en jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un 5 al 10 % de anhídrido carbónico (CO2).
c. Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxígeno, el cual les es sumamente tóxico e impide su crecimiento.
d. Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxígeno y tienen la facultad de también crecer en aerobiosis.
Según la temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden ser: a. Mesófilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la
tempe-ratura del cuerpo humano o a la tempetempe-ratura del ambiente. En este grupo se incluyen todas las bacterias patógenas, por esta razón la tem-peratura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadoras bacteriológicas es de 36 grados centígrados.
b. Termófilas: Crecen a altas temperaturas (calor). c. Criófilas: Crecen a bajas temperaturas (frío).
d. Psicrotróficas: Crecen a temperaturas de refrigeración. Según su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos:
a. Cocos: Son bacterias de forma esférica o redondeada. Ejemplo, Foto A página siguiente: Microfotografía de Staphylococcus aureus en división. b. Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o
bastoncillo. Ejemplo, Foto B página siguiente: bacilos en división. c. Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o
espiral. Ejemplo, Foto C página siguiente: Microfotografía de bacterias de la microbiota oral; Treponema sp. (espiroquetas), bacilos y cocos. Dependiendo de su forma de agrupación los cocos pueden clasificarse así: a. Diplococos: Agrupación de bacterias esféricas en grupos de dos, o
parejas (ejemplos: Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae). b. En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)
c. En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)
A B
CÓMO ORGANIZAR EL ÁREA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGÍA Para poder trabajar bacteriología médica, se requiere del siguiente material y equipo básico, según se ilustra en la figura 1 (pág. 34).
1. Una superficie lisa del alto de un escritorio de oficina (76 a 78 cm de alto), material liso, blanco o negro mate, lavable, tipo fórmica. El lugar de trabajo debe estar lejos de ventanas que permitan corrientes de aire, lavatrastos o basureros. Contar con una silla cómoda, giratoria, con respaldo, y ajustable al alto adecuado. 2. Un mechero quemador de gas propano tipo Meker, Bunsen o “Touch-O-Matic”. Ajustar la entrada de aire a manera de obtener una llama azul y translúcida (no amarilla). Debe tenerse presente que solamente es estéril el aire que está un pie (30 cm) alrededor del mechero encendido, por lo que se debe trabajar lo más cerca posible. Situarlo al frente ligeramente hacia la derecha. También puede usarse incinerador.
3. Una campana bacteriológica de madera o fibra de vidrio para aislar el área de trabajo, la cual debe desinfectarse diariamente antes de iniciar el trabajo. Frotar-la por dentro con formol al 10 por ciento, fenol al 1 por ciento, o por lo menos con alcohol al 70 por ciento. La campana no es indispensable; puede trabajarse sin ella, si se hace con cuidado, es decir sobre una superficie desinfectada y cerca del me-chero.
4. Un autoclave para esterilizar con calor húmedo a presión, material y me-dios de cultivo, “matar” material contaminado y cultivos (esterilizar previo des-carte o limpieza). Puede ser pequeño, tipo olla de presión. Calibrarlo a manera de autoclavear siempre por 15-20 minutos a 121o C y 15 libras de presión por pulga-da cuadrapulga-da.
5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con fórmica, con las siguientes asas de “nichrome” (aleación de níquel y cromo), según se ilustra en la figura 2 (pág. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de platino puro en anillo pequeño para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos). Para trabajar Micología (hongos) debe contarse también con asa espatulada, asa en “L” y dos agujas de disección. Las asas bacteriológicas deben ponerse rectas y lim-piarse diariamente. Esto se hace fácilmente haciéndolas rodar en el suelo deslizan-do el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa. Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que ya está fría.
6. Una lámpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de “cuello de ganso”; colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuerte-mente el área sobre la mesa, pero que la luz no dé directafuerte-mente a los ojos.
7. Microscopio óptico binocular de buena calidad, con condensador de cam-po oscuro.
8. Lupa o de preferencia microscopio estereoscópico para observar bien las colonias.
9. Incubadora bacteriológica que debe mantenerse constantemente a 36o C exactos (no a 37o C ó a 35o C). Debe mantenerse siempre cerrada y pegarle una hoja de control diario de temperatura.
10. Balanza para pesar medios de cultivo.
11. Hornilla eléctrica de dos discos y temperatura graduable. 12. Refrigerador con congelador.
13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tien-das, con tapadera metálica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras (velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres microaerofílicos.
14. Jarro Gas-Pak (BBL) o similar, sobres generadores de anaerobiosis, catalizadores e indicadores para incubar cultivos anaerobios.
15. Agitador de tubos tipo “vortex”.
16. Colorantes, soluciones y medios de cultivo según se describe en cada capítulo.
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
LA COLORACIÓN DE GRAM Las bacterias son microorganismos incoloros, por este motivo deben teñirse para poder observarlos con ayu-da del microscopio. Por esta razón, a continuación se des-cribe la técnica más importante que debe usarse para di-ferenciar bacterias: la coloración de Gram. Se recomienda usar la modificación de Hucker según Bartholomew, de acuerdo con la bibliografía que aparece al final de este manual.
a) Preparación de frotes:
La coloración de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetos de vidrio (también llamados frotis) de todo tipo de muestras clínicas, o a frotes de suspensiones de cultivos. Frotar la muestra suavemente y sin revolver mucho so-bre la superficie de un portaobjetos limpio y seco. Esperar que seque soso-bre una superficie lisa o flamear muy levemente. Rotular adecuadamente con crayón graso por detrás de la lámina. Una vez que el frote ya está seco, fijar pasando levemente por la llama del mechero dos veces, sin que se caliente excesivamente (que no que-me al ponerlo sobre la piel del dorso de la mano). Dejar que el frote se enfríe antes de colorearlo, pues si se colorea caliente precipitan los colorantes.
Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frote debe hemolizarse con agua. Proceder así: dejarlo secar y fijar con calor, cubrir comple-tamente con agua del chorro un minuto, y luego proceder a colorearlo con Gram. Este tratamiento permite destruir los eritrocitos y poder observar las bacterias.
b) Técnica de la coloración de Gram:
1. Cubrir el frote ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto (ver preparación de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de agua corriente. Escurrir muy bien.
2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo sua-vemente con agua corriente, escurrir bien.
3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 ó 5 segundos, hasta que ya no salga más cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breve en frotes delgados y más prolongado en frotes gruesos.
4. Cubrir el frote con safranina sólo por 30 segundos. Enjuagar suavemente con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a 36° C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire obtenido de una pera de hule o un secador para manos.
5. Examinar en el microscopio con el lente de inmersión, con aceite especial de viscosidad adecuada.
c) Resultados:
Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro. Bacterias gram-negativo: rojo.
La diferencia de coloraciones se debe al grosor de la pared celular, que es más “delgada” en las bacterias gram-negativo. Esta coloración sólo es válida para cocos y casi todos los bacilos (excepto micobacterias), no es válida para espiroquetas. Si el frote es de material clínico, es decir de muestras de pacientes, debe quedar rojo a simple vista después de colorearlo. Si hay leucocitos presentes en la muestra éstos deben ser rojos negativo) y si hay levaduras deben verse azul-morado (gram-negativo), lo que sirve para evaluar si el frote se decoloró adecuadamente.
d) Informe:
El reporte correcto de una bacterioscopía (observación de bacterias) con Gram debe contener los siguientes elementos y en este orden:
1. Identificación del paciente (apellidos, nombres, número de registro o afiliación, servicio y fecha).
2. Título que indique el tipo de muestra examinada y el sitio anatómico de donde proviene. Por ejemplo: Secreción de úlcera en miembro inferior derecho. Coloración de Gram:
3. Mencionar primero las bacterias observadas. Empezar por la clase más freuente en la muestra, indicar agrupación y cantidad (muy escaso, escaso, regular cantidad, abundante o muy abundante ó +, ++, +++, ++++). Por ejemplo: cocos gram-positivo en cadenas cortas: abundantes; bacilos gram-negativo: regular can-tidad, diplococos gram-negativo: muy escasos. Usar siempre positivo y negativo
en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en plural.
4. Luego es muy importante para el médico saber si hay glóbulos blancos en la muestra, su clase y cantidad. Por ejemplo: Leucocitos polimorfonucleares: abun-dantes. Este dato indica que hay verdadera infección y que la muestra era purulenta. Si se observan bacterias dentro del citoplasma de los leucocitos, mencionar “intracelular” en el reporte, lo que es de especial interés clínico en los frotes de secreciones uretrales masculinas. La presencia de linfocitos indica infección cróni-ca o viral (no purulenta).
5. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras o micelio de hongos (gram-positivo); de células epiteliales, de especial interés en frotes de esputo (se miran gram-negativo aplanadas con citoplasma grande, transparente y núcleo pequeño redondo u ovalado). Aunque no es crucial, indicar la presencia de fibrina, que se mira en forma de hebras gram-negativo alargadas e irregulares.
6. Cuando es necesario, con experiencia y cautela podrán incluirse al final comentarios sobre la calidad de la muestra, indicar que la morfología observada es compatible con una especie de bacterias o recomendaciones de tratamiento (con mucha prudencia).
Reactivos para la coloración de Gram: (Modificación de Hucker según Bartholomew) 1. CRISTAL VIOLETA:
Solución “A”:
Cristal violeta (certificado) ... 2 gramos Alcohol etílico al 95 % ... 20 ml Solución “B”:
Oxalato de amonio ... 0.8 gramos Agua destilada ... 80 ml
Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24 horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloración.
2. LUGOL DE GRAM:
Cristales de yodo ... 1 gramo Yoduro de potasio ... 2 gramos
Agua destilada ... 300 ml
Moler en un mortero el yodo y el yoduro. Agregar el agua destilada (en probeta) poco a poco. Continuar moliendo para disolver completamente; agregar el agua a manera de ir lavando el mortero, hacia una botella de vidrio oscuro (ámbar). Sólo dura una semana.
3. ALCOHOL-ACETONA (Decolorante):
Mezclar volúmenes iguales de acetona pura (para análisis) y alcohol etílico al 95 %.
4. SAFRANINA:
Solución stock (concentrada):
Safranina-0 (certificada) ... 2.5 gramos Alcohol etílico al 95 %. ... 100 ml Solución de trabajo:
Diluir 1:10 la solución stock (concentrada), así:
Solución stock ... 10 ml Agua destilada ... 90 ml
Solución anticorrosiva para desinfectar bisturíes: Formaldehido (Formol) ... 8 % Alcohol etílico ... 60-70 % Nitrito de sodio ... 0.2 % Para preparar un litro:
En un balón aforado de 1,000 ml (1 litro), colocar 2 gramos de nitrito de sodio, luego agregar 700 ml de etanol absoluto y 200 ml de formaldehido al 40 %. Luego aforar con 100 ml de agua destilada.
Los bisturíes con sus mangos deben mantenerse constantemente sumergidos en esta solución, dentro de un recipiente de acero inoxidable con tapadera.
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
ASAS PARA BACTERIOLOGÍA: ASAS PARA BACTERIOLOGÍA: ASAS PARA BACTERIOLOGÍA: ASAS PARA BACTERIOLOGÍA: ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:
1.
Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de
nichrome. Sirve para siembra por estrías e inoculaciones en general.
2.
Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de
identificación, o subcultivo.
3.
Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para
urocultivo.
4.
Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.
ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:
ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:
ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS: ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:
5.
Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y
procedimientos especiales.
6.
Aguja de disección con punta aguda, para purificar colonias pequeñas
y distribuir las preparaciones de hongos en fresco.
4. Flamear segunda vez, al terminar la segunda estría.
Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
SÓLIDOS POR ESTRÍAS
SÓLIDOS POR ESTRÍAS
SÓLIDOS POR ESTRÍAS
SÓLIDOS POR ESTRÍAS
SÓLIDOS POR ESTRÍAS
5. Tercera estría. Debe tocar ligeramente la segunda estría, y cubrir toda la superficie libre del medio sin tocar al final el inóculo original.
1. Con asa o hisopo estéril, estriar inóculo original de aproximadamente 0.5 cm, en el borde de la caja de Petri.
2. Flamear primera vez al terminar el inóculo original.
3. Segunda estría cruzada, debe tocar ligeramente el inóculo original.
CAPÍTULO 3
COPROCULTIVO
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea, dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.
Las principales especies enteropatógenas que se buscan en el coprocultivo, en orden de importancia en Guatemala son:
- Shigella flexneri (Shigella grupo B)
- Salmonella typhi (agente de fiebre tifoidea)
- Shigella sonnei (Shigella grupo D)
- Salmonella enteritidis
- Shigella dysenteriae tipo 1 (Shigella A-1 o “Bacilo de Shiga”, causa severa disentería epidémica) - Shigella boydii (Shigella grupo C, rara en Guatemala) - Salmonella choleraesuis
- Arizona hinshawii (rara)
- Edwardsiella tarda (muy rara)
- Yersinia enterocolitica (muy rara)
Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el in-testino humano, por lo que se conocen comúnmente como “enterobacterias”. For-man aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacte-rias anaerobias. Por esta razón es muy importante que el laboratorio esté en capaci-dad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatógenos de la lista anterior.
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras: - heces frescas (la mejor muestra)
- material obtenido por proctoscopía - biopsia de mucosa intestinal
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas de ser emitidas; no es necesario que el paciente esté en ayunas. El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa. En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros, dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los niños, introducir el hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es más fácil tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y él mismo separándose los glúteos. Los niños deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego introducir el hisopo.
Cuando las heces, que se encuentran a 37° C dentro del intestino, son colecta-das y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20° C), el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pier-dan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón si la mues-tra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un me-dio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propó-sito colocar con hisopo estéril una porción anormal de las heces (con moco, sangre o pus) aproximadamente del tamaño del hisopo bien cargado en tubos o viales con 3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36°C por aproximadamente 18 horas antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de glicerol-salino bufferado.
Glicerol salino bufferado
Para transporte de coprocultivos
Cloruro de sodio ... 4.2 gramos Fosfato dipotásico (anhidro) ...3.1 gramos Fosfato monopotásico (anhidro) ...1.0 gramos Rojo fenol ...0.003 gramos Agua destilada ...700 ml Glicerina ...300 ml
El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapón de rosca y luego autoclavear a 121°C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica y vira a color amarillo.
Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo no deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya que su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considera-blemente su utilidad clínica.
La coloración de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de signi-ficado clínico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causada por Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o en caso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras (gram-positivo).
PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses. Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (con-tienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo) y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produ-ce ácido, lo que haprodu-ce cambiar el color de las colonias y así las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfhídrico. El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes, de preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar MacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella).
En caso de heces con moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal y proctoscopía.
El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, en estos tres medios que contienen el azúcar lactosa (como agente diferencial) es el siguiente:
Efectúe el coprocultivo así:
1- Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de mues-tra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inóculo se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambos medios. Inocular sólo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.
2- Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas mientras la otra se enfría (ver figura 3, pág. 40).
3- Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas, incubar a 36°C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura con-trolada diariamente (ver figura 4, pág. 45).
COLOR ANTES DE INOCULAR rosado rosado ligeramente amarillento verde claro rojo MEDIO MacConkey SS Hektoen XLD COLONIAS CON ÁCIDO SULFHÍDRICO no cambian negro negro negro COLONIAS LACTOSA-NEGATIVO incoloras incoloras verde azuladas rojas COLONIAS LACTOSA-POSITIVO rojo (rosado) rojo anaranjado-salmón amarillas
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Muestras: I N O C U L A R Rutina Hektoen XLD ó SS MacConkey
Diseminar por estrías, incubar a 36o C
Heces frescas
Medios:
Seleccionar colonias según el caso, trasladar a TSI/LIA/urea
Material de proctoscopía, biospia intestinal
Hisopo rectal Sedimento de
enema salino
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
1- Después de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cada paciente simultáneamente. Debe contarse con una luz de lámpara que ilumi-ne las cajas por detrás y observarlas utilizando una lupa corriente. Marcar por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de colonias sos-pechosas así: Primero escoger en el MacConkey una colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras), empezando por las colonias más peque-ñas (más o menos 1 mm de diámetro). Si el paciente es un niño menor de un año, se marcará adicionalmente en el MacConkey una colonia típica de Escherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa), de la parte de la caja donde las colonias están más separadas y ponerle con crayón graso por detrás “C” al lado. Examinar el SS de la misma forma. En este medio el crecimiento será más escaso pues es más inhibidor. Marcar por detrás una colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando por las más pequeñas, e incluyendo una colonia con centro negro (ácido sulfhídrico) si las hay. Si se inoculó Hektoen, marcar una colonia pequeña verde azulado (lactosa-negativo).
Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Marcar colonias sospechosas por
detrás de la caja de Petri
CRA YÓN GRASO
2- El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscópico para hacer los sub-cultivos con asa en aguja o recta así:
Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio estereoscópico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y frías, acostúmbrese a usarlas según se indica a continuación: apoyándose en el borde del microscopio con los dedos meñique y anular de la mano derecha (izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lápiz y bájela lentamen-te hasta que aparezca en el campo del microscopio y sólo toque la superficie de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo) con el dedo meñique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exacta-mente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y luego haga un estriado rápido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una estría en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colo-nia de igual morfología). Si no cuenta con microscopio estereoscópico proce-da así:
Tome la caja ya marcada de MacConkey, XLD o SS Hektoen entre los dedos pulgar, índice y medio de la mano izquierda (retraiga los dedos anular y me-ñique). Colóquela verticalmente a manera que la luz pase por detrás a través de la caja, tome su asa recta agarrada como un lápiz con la mano derecha, apoye firmemente los dedos anular y meñique en la palma de su mano iz-quierda que sostiene la caja. Acerque cuidadosamente el asa y toque con mucho cuidado la colonia seleccionada sin pincharla ni tocar otras colonias cercanas. (ver figura 6, pág. 48). Inocule simultáneamente una pareja de TSI/LIA y urea agar según ya se describió. Estos tres medios en tubo deben tener 2.5 cm de fondo y 3.8 cm de superficie inclinada para que funcionen correctamente, Rotular ambos tubos y colocarlos por pareja en gradillas. Si el MacConkey sólo presenta colonias lactosa-positivo (rojas) descártelo. Lo mismo se hará con el Hektoen que sólo presenta colonias lactosa-positivo (anaranjado sal-món), o el XLD que sólo presenta colonias amarillas. Reincube la caja de SS otras 24 horas a temperatura ambiente para investigar la presencia de Yersinia enterocolitica.
Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
3- Incube a 36°C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no quede duda de qué tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en incubación de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente flojos para permitir la entrada de oxígeno. Las colonias marcadas “g” (E. coli, niños menores de un año) pueden pasar sólo a TSI, para ahorrar LIA y urea. 4- Examine las reacciones coloreadas en el TSI/LIA simultáneamente; tome ambos tubos juntos hacia abajo con la mano derecha y obsérvelos contra la luz. Interprete resultados de acuerdo a la siguiente tabla.
Reacción ya incubada Medio sin inocular TSI (rojo) LIA (morado) ácido sulfhídrico (h) (-a+++) negro negro A=ácido Amarillo Amarillo K=alcalino rojo violeta R=rojo no aplicable Superficie roja N=neutro no aplicable antre amarillo y morado Gas (g) (-a+++) burbujas o rupturas burbujas o rupturas
Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte; negativo = no hay cambio
Bacteria Shigella spp. Salmonella sp. Yersinia enterocolitica TSI K/A,g-,h-K/A,g+,h++ A/A,g-,h-LIA K/A (N),g-,h-K/K,g+,h+ A (K)/A,g-,h-UREA -+ Reacción ya incubada Medio sin inocular
Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/ fondo, gas, ácido sulfhídrico.
Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así: TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- o
TSI;LIA = K/A, g-; /K/N, g-,
h-Las reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy útiles para la identificación de los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tabla actualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioquímicas en general.
5- Los tubos de TSI, marcados “g” y que corresponden a coprocultivos de niños menores de un año deben aglutinarse para investigar Escherichia coli enteropatógena (“pools” A, B y C) (Según Dr. Myron Levine, U. de Maryland VI Congreso C.A. de Microbiología, comunicacion personal). El informe final deberá reportarse así: “Se aisló Escherichia coli enteropatógena del grupo ___ ” . Debe hacerse notar que aunque el valor cIínico de esta prue-ba ha sido puesto en duda, ya que también existen E. coli invasivas y produc-toras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la aglutinación para demostrar la presencia de serotipos clásicos enteropatógenos en los niños pequeños. Inocule una asada pequeña en caldo tripticasa soya o caldo BHI (infusión de cerebro y corazón de buey), proceda efectuar la prue-ba de susceptibilidad antimicrobiana según el método de Bauer-Kirby, des-crito más adelante. Si no se observa ninguna aglutinación, ni se aisla Shigella o Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe redactarse así: “Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli enteropatógena”. (Sólo para niños menores de un año). Las claves sugeridas para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y aceleran el trabajo.
REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA Enterobacteria Escherichia coli Shigella spp.* Salmonella typhi* Salmonella spp.* Arizona hinshawii* Yersinia enterocolitica* Citrobacter sp. Edwarsiella tarda Klebsiella sp. Enterobacter sp. Serratia sp. Proteus vulgaris Proteus mirabilis Morganella morganii (antes Proteus morganii) Providencia sp. LIA K/KóN, g-ó+, K/A, g-, h-K/K, g-, h-(+) K/KóN, g-, h+ (-) K/KóN, g-, h+ (-) A(K)/A, g-, h-K/A, g-ó+, h+ó-K/K, g-ó+, h+ KóN/KóN, g+ó, KóN/KóN, g+(-), KóN/KóN, g-, h-R/A, g-, h-(+) R/A, g-, h-(+) KóR/A, g-, R/A, g-, h-UREA -+ + ó -+ -(+) - ó + + + + -TSI A(K)/A, g+ (-), K/A, g-, h-K/A, g-, h+ (poco) K/A, g-, h+++(-) K(A)/A, g+, h+++ A/A, g-, h-K(A)/A, g+, h+++(-) K/A, g+, h+++ (indol +) A/A, g++, h-(mucosidad ++) A/A, g++, KóA/A, g-, h-A(K)/A, g+, h+++ K(A)/A, g+, h+++ K/A, g-(+), h-K/A, g+ ó-, h Nota Importante:
Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre paréntesis. Todas las reacciones con reacción roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clínica en coprocultivos y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es sólo una guía, que debe actualizarse
constantemente.
-DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SHIGELLA: TSI y LIA =
K/A,g-,h-Oler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a “semen” es caracte-rístico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la más frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni ácido sulfhídrico y tienen un color “amarillo canario”. La reacción K (alcalino) de la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el creci-miento del TSI sospechoso, o del LIA así:
Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ráyela con crayón graso por detrás a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos de aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA con reacción sospechosa de Shigella, en orden numérico en una gradilla. En la mis-ma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reacción sospe-chosa de Salmonella y los TSI marcados “C” (Escherichia coli) para proceder a aglutinar. Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro de un cuadrito una gotita de antisuero “Shigella grupo B” (Shigella flexneri). Aglutine tomando una porción pequeña del crecimiento en TSI (puede ser también del LIA) con asa en anillo estéril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en óvalo pequeño sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera de obtener una suspensión ligeramente lechosa. Observe inmediatamente después de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrás la aparición de aglutinación franca y obvia.
Sólo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto después de mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina siga aglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, que son muy caros:
1- Shigella flexneri, grupo B - La más frecuente en Guatemala 2- Shigella sonnei, grupo D - La segunda más frecuente en
Guatemala
3- Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidémica, debe darse alerta al médico.
DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SALMONELLA: La taxonomía moderna del género Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines prácticos de diagnóstico y de investigación, se recomienda usar la clasificación an-tigua simplificada así:
- Salmonella typhi: causa fiebre tifoidea con diseminación genera-lizada de la bacteria (puede aislarse de heces, médula ósea, sangre, orina, etc).
- Salmonella enteritidis: causa infección intestinal y puede diseminarse a la sangre.
- Salmonella choleraesuis: rara, causa infección en animales y rara vez en el hombre.
Salmonella typhi presenta en TSI dos características muy importantes para su identificación, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons y aglutinación:
1- No produce gas.
2- Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra, a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza el inclinado).
3- Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+) 4- Es citrato-negativo.
5- Aglutina con el antisuero anti-antígeno Vi.
El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se prepara inclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada del crecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a 36°C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan así:
verde = negativo azul = positivo
Diferencie presuntivamente las especies del género Salmonella con estas tres pruebas sencillas:
(+) = positivo lento, más de 3 días de incubación.
En resumen, para diferenciar e identificar Salmonella siga estos pasos: 1- Identifique las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi y
Salmonella spp. según la tabla. Es muy importante notar la reacción toda morado-violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color lo cual es típico del género Salmonella. Anote la cantidad de ácido sulfhídrico en el TSI.
2- Ordene sus TSI/LIA/urea en la gradilla de tubos para aglutinación y, según ya se explicó, aglutine todos los TSI con una gota de antisuero comercial polivalente de Salmonella.
3- Si la reacción es positiva, inocule un tubo de citrato de Simmons e incube, simultáneamente inocule la prueba de susceptibilidad antimicrobiana. 4- Si el laboratorio cuenta con el set de antisueros de grupo de Salmonella, aglutine
sólo los tubos con aglutinación franca en el antisuero polivalente a Salmonella en los antisueros de grupo. Algunos grupos frecuentes en Guatemala son B, G, y C1. Salmonella typhi pertenece al grupo D, por lo que aglutinación positi-va a este grupo, además de las otras pruebas sencillas confirma esta especie. Si se investiga el grupo, éste debe informarse, por ejemplo:
Se aisló Salmonella enteritidis del grupo B.
Idealmente el laboratorio podrá confirmar con más seguridad y mayor Ácido sulhídrico (TSI) + débil +++ + (sólo 60%) Gas (TSI) -+ + Citrato -+ (+) Prueba Especie Salmonella typhi Salmonella enteritidis Salmonella choleraesuis
