Curva melting

La curva de fusión o curva melting se usa para la identificación de diferentes productos de la reacción, incluidos productos inespecíficos. Al completarse la reacción de amplificación, se genera una curva de fusión al incrementar la temperatura en pequeños aumentos y al controlar la señal fluorescente en cada paso. A medida que el dsDNA en la reacción se desnaturaliza, la fluorescencia disminuye. La primera derivada negativa del cambio en la fluorescencia se representa en función de la temperatura. Un pico característico a la temperatura de fusión del amplicón (Tm, la temperatura a la que se separan el 50% de los pares de bases de un dúplex de ADN) lo distingue de otros productos, como los dímeros de cebadores, que se funden a diferentes temperaturas (Bio- Rad Laboratories, Inc., 2006). En las gráficas 11 y 12 se observa el pico característico que indica que los primers utilizados para el gen NCED son específicos para la región de interés.

.

8.6.1.1Curva melting

En cuanto a la curva de fusión se pueden observar dos picos evidenciando la agrupación y especificidad del gen normalizador Actina y el gen de interés NCED1. Generándose el primer pico entre los 70 °C y 76°C y el segundo entre los 75°C y 81°C.

8.6.2 Cuantificación absoluta RT-PCR

Dentro de la normalización de los protocolos de RT-PCR, es necesario tener en cuenta la calidad y concentración de las muestras de ARN a evaluar. En este sentido las muestras de ARN total almacenado se cuantificaron, seleccionando las más óptimas para el ensayo. Luego de conocer la concentración de ácidos nucleicos se hicieron los cálculos correspondientes para las diluciones tanto de los estándares como de las muestras problema. En el caso de las muestras problema con altas cantidades de ARN (>1000 ng/μl), se llevaron a una concentración de 500 ng/μl y luego a una concentración de 100 ng/μl. En el caso de los estándares (Std), se tomó en cuenta una muestra de ARN control diluida en 6 concentraciones diferentes, a partir de una inicial de 100 ng/μl (Std 1), 75 ng/μl (Std 2), 50 ng/μl (Std 3), 25 ng/μl (Std 4), 12,5 ng/μl (Std 5) y 6,25 ng/μl (Std6) los cuales deben ser especificados en la configuración en la interfaz del termociclador. Se realizaron tres ensayos de RT-PCR, el primero contemplando muestras de la cosecha (estándares y 7 muestras problema), el segundo empleando muestras de la cosecha y postcosecha ( 3 estándares y 12 muestras problema) y el tercero contemplando muestras de la cosecha y postcosecha y usando un gen normalizador actina, pata análisis de cuantificación absoluta y relativa.

Gráfica 13 Curva Melting (Izquierda) y pico Melt (derecha) RT-PCR relativa. Color Magenta gen Actina y Color Azul gen

Cosecha

Dosis Gy Muestras Log _C CT Expresión

Control 2,000 27,69 100,00000 50Gy Familia 30 1,603 29,43 40,08600 25Gy Familia 49 2,072 27,87 118,032 25Gy Familia 102 2,347 26,96 222,33 25Gy Familia 13 1,389 30,14 24,49060 50Gy Familia 22 2,595 26,13 393,55000

Gráfica 14 Amplificación (arriba) y curva estándar (abajo) con los respectivos estándares y muestras problema de la cosecha.(1er ensayo)

la cosecha.

Tabla 7 Valores de las muestras evaluadas en RT-PCR

Se puede observar en la gráfica de amplificación (Grafica 14 – arriba) que las muestras empezaron la fase exponencial desde los 24 a 30 ciclos, llegando a la fase lineal después de los 32 -35 ciclos con un valor respectivos de 1000 en Fluorescencia (RFU). En cuanto a la Curva estándar (Gráfica 14–abajo) podemos observar los valores de las muestras problemas distribuidas a través de la recta que representan el punto y el ciclo en el cual el suficiente producto se acumula para producir una señal fluorescente detectable basado en los estándares establecidos (CT). Las familias que evidencian un nivel de expresión mayor corresponden a las familias 39, 102 y 49, siendo la primera una de las familias irradiadas a una dosis de 50Gy, seguida de dos ejemplares de las familias irradiadas con una dosis de 25Gy. Las anteriores se referencian con el estándar uno (Std1) el cual posee una concentración de 1,00E+02. Respecto a los estándares 3 y 4 (Std 3 y Std 4) se encontraron ubicadas a las familias 30 y 13, irradiadas con dosis de 50Gy y 25Gy respectivamente. Esto nos indica que las familias de 25Gy evaluadas presentan una mayor cantidad de número de copias del gen NCED en el momento de la cosecha.

Gráfica 15 Amplificación (arriba) y curva estándar con muestras

En cuanto a la RT-PCR en la cual se contemplaron las muestras de ARN aislado de los meristemos en el momento de cosecha (Figura 34-A) y postcosecha donde los meristemos presentaban un tamaño ~7mm (Figura 34-C), se observa en los resultados (grafica 15) amplificación en el inicio de la fase exponencial (CT) desde los 25 ciclos hasta los 30 ciclos, en la mayoría de las familias evaluadas y presentándose una familia (10) con un inicio de amplificación (CT) a los 38,22 ciclos, indicando que existe un nivel bajo de expresión para el gen NCED de concentración de 4,170E+00 respecto al estándar más cercano de concentración (Std 4) de 2,500E+01, lo cual se enienderia porque esta muestra hace parte del grupo de postcosecha, donde se cree que el nivel de expresión del gen de interés es más bajo, esta condición la comparte la familia 11, sin embargo, este última supera el estándar más cercano (Std 4), con una concentración de 3,098E+01. Respecto a la curva estándar, se evidencia que las familias 3 y el grupo control postcosecha tienen una mayor expresión del gen de interés, pues poseen una concentración de 2,528E+02 y 1,652E+02 respectivamente, en comparación al primer estándar (Std 1) de concentración 1,000E+02. Lo anterior devela que los altos niveles de expresión del gen NCED estarían relacionados con el estado vegetativo de la semilla o tubérculo y que no cambia hasta que es sembrado, destacando la familia 3 irradiada a una dosis de ´{ñ50Gy. En cuanto a las familias 49, 17, 102, 56 y 143 poseen niveles de expresión cercanos al estándar 3 (Std 3) 5,000E+01 con concentraciones 3,098E+01, 5,775E+01, 5,775E+01, 5,775E+01 y 5,775E+01 respectivamente.

Cosecha - Post Cosecha

Dosis Gy Muestras Log C CT Expresión 25Gy (Cs) Familia102 1,72 31,93 52,48075 50Gy (Pc) Familia10 0,604 38,42 4,01000 25Gy (Cs) Familia 143 1,557 32,88 36,05780 50Gy (Cs) Familia 56 1,585 32,72 38,45910 25Gy (Cs) Familia 49 1,864 31,1 73,11390 CPST 2,219 29,03 165,57690 50Gy (Pc) Familia 3 2,406 27,94 254,68300 50Gy (Cs) Familia 17 1,765 31,67 58,21030 50Gy (Pc) Familia 11 1,491 33,27 30,97410 Tabla 8 Valores de las muestras evaluadas en RT-PCR

Según los datos obtenidos de expresión, calculado con el antilogaritmo con base 10 (Ecuación 2), las plantas irradiadas con 50Gy presentan una expresión del gen NCED tanto en la cosecha como en la postcosecha, los niveles de expresión de las plantas de 25Gy son bajos a comparación del control y las familias irradiadas a 50 Gy (Tabla 7). Se evidencia que la radiación con 50Gy causo un aumento de expresión de este gen, lo que influye en un posible aumento del periodo de dormancia de los tubérculos de papa criolla. Se hace una relación de las expresiones calculadas de la RT-PCR de cuantificación absoluta, para ilustrar mediante un diagrama de barras los distintos niveles de expresión de las familias evaluadas.(Ver Gráfica 16).

Con los datos de expresión, se obtuvo un ANOVA para analizar la varianza de los datos por medio del programa Past3 teniendo en cuenta las dosis de radiación. El valor del estadístico de prueba F (4.055) es distinto de 1 para cualquier nivel de significancia, lo que permite rechazar la Ho (Hipótesis nula) de igualdad de medias. El test de Kruskal-Wallis indicó que no existen diferencias significativas entre las medianas de las muestras.

Gráfica 16 Diagrama de barras niveles de expresión Gen NCED (Cuantificación

8.6.3 Cuantificación Relativa RT-PCR

Para la implementación de la cuantificación relativa es necesario tener un gen de referencia, en este caso se tomo el gen actina ya que es un gen constitutivo de las células vegetales y por lo tanto se esta expresando de manera constante. Se utilizaron y estandarizaron los primers disponibles en el material del laboratorio que se relacionan a continuación.

Tabla 9 Primers Actina,gen normalizador.

GEN SECUENCIA PRIMER (5’-> 3’) Tm Pb

Actina >XM_015767607.2 F AATCAAAGCAAGTGGCAAGC 57.84 181

R TCGATGTGGTTTTCTGCATC 56.43

Se realizó una PCR convencional con seis gradientes de temperatura para verificar las temperaturas de anillamiento de los primers calculada de manera teórica siguiendo los protocolos explicados en el numeral 8.5. Según los resultados de la electroforesis se determinó que la temperatura de anillamiento para estos cebadores es de 59 °C (Figura 39).

La configuración para la RT-PCR cuantificación relativa, se estructuró de un ciclo de 10 minutos a 50 °C para la incubación de las muestras, un segundo ciclo de 95 °C por 3 minutos, un tercer ciclo de 95 ° C por 10 segundos, un cuarto ciclo con gradiente de temperatura con un rango de 1 °C (De 58,1 °C – 59.1 °C) para tener en cuenta las temperaturas de anillamiento de los primers tanto de actina como NCED1 por 30 segundos el cual se repitió 40 veces, con las correspondientes lecturas del plato, un ciclo con configuración de Melt Curve 58.1 °C a 94,1 °C, con un incremento de 0,54 °C por 5 segundos para la lectura del plato. Un quinto ciclo de 72 °C por un minuto y un ciclo final a 4 °C por 10 minutos. Se realizaron las respectivas diluciones del RNA total y los estándares (como se explica en el numeral 8.6.2), aunque la literatura dice que para una RT-PCR de cuantificación relativa no es necesario realizar estándares.

8.6.3.1Amplificación y curva estándar

Se puede observar que la amplificación (gráfica 17 - arriba) de las muestras con primers de Actina comienzan en el ciclo (ct) 23.5 hasta el ciclo 27.3 mientras que las muestras con los primers de NCED1 van desde los 27.8 a los 33.5 ciclos. Esto se debe a que la longitud de pares de bases del

Figura 37 Gel de agarosa revelado con productos de la PCR convencional

con seis gradientes de temperatura: M: marcador molecular; 1: 57.0°C ;2: 58.3 °C; 3: 59 °C; 4: 60.6 °C; 5: 61.1 °C; 6:62 °C.

primero es inferior al del segundo, evidenciándose una amplificación tardía del segundo. En la gráfica de curva estándar (grafica 17 – abajo) se puede observar que las muestras de postcosecha (Familias 10, 11 y 43) son de las primeras en cruzar el umbral, mostrando una mayor expresión absoluta respecto a las muestras de cosecha.(Familias 30, 143, 63, 13, 97, 102, 44, 106, 22, 17, 56).

Se realizó el cálculo de la expresión de cada uno de las familias evaluadas en el tercer ensayo tomando como control positivo las muestras del mismo ARN con primers de actina, se observa en la gráfica 18 mayor número de muestras que expresan el gen NCED para las familias de 50Gys (13,30,17,11,43 y 10) siendo mayor la expresión en el momento de postcosecha (Familias 10,11 y 43).

Dosis Gy Muestras Log C CT Expresión

25Gy (Cs) Familia 97 1,976 29,00 94,62 25Gy (Cs) Familia 63 3,014 27,73 1032,76 25Gy (Cs) Familia 56 0,000 0,00 0 25Gy (Cs) Familia 143 0,980 31,00 9,55 25Gy (Cs) Familia 106 0,143 33,00 1,39 25Gy (Cs) Familia 102 0,778 29,00 5,99 25Gy (Cs) Familia 49 2,301 29,00 199,98 25Gy (Cs) Familia 22 1,863 30,00 72,94 50Gy (Cs) Familia 13 0,750 32,24 5,72 50Gy (Cs) Familia 30 2,153 29,00 142,23 50Gy (Cs) Familia 17 0,971 31,00 9,35 50Gy (Pc) Familia 11 2,971 27,00 935,4 50Gy (Pc) Familia 43 2,329 29,00 213,3 50Gy (Pc) Familia 10 3,411 26,00 2576,33

Tabla 10 Cuantificación Absoluta de la expresión NCED1

Gráfica 18 Diagrama de barras niveles de expresión Gen NCED (Cuantificación absoluta). Postcosecha y Cosecha. Familias 97-22 (25Gy) Familias 13-10 (50Gy)

8.6.3.2 Análisis de Expresión génica

Se hizo una comparación de niveles de expresión entre el gen normalizador Actina con el gen de estudio. Las gráficas y los cálculos fueron realizados por el programa CFX Manager Software Data Analysis (BIO-RAD).

Según Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006, el método ∆Ct que utiliza un gen de referencia es una variación del método Livak, facil de realizar y brinda esencialmente los mismos resultados. Este método utiliza la diferencia entre los valores de Ct de referencia y de destino para cada muestra Anexo XXX mediante el cual se obtienen resultados de una expresión normalizada. Se tiene en cuenta el nivel de expresión del gen de referencia en este caso Actina. La diferencia clave en los resultados es que el valor de expresión de la muestra del calibrador no es 1.0. Si los valores de expresión resultantes obtenidos en este método se dividen por el valor de expresión de un calibrador elegido, los resultados de este cálculo son exactamente los mismos que los obtenidos con el método 2∆∆t

Relación (Actina/ NCED1) = 2CT (Actina ) - CT (NCED1)

Gráfica 19 Barras de expresión génica entre gen de referencia Actina y el gen objetivo NCED1 obtenido por

En la gráfica 19 se relacionan la cantidad relativa de cambios de expresión en las familias evaluadas para las muestras de Actina y de NCED1. Es evidente que en las familias de postcosecha (10, 11 y 43) los niveles de expresión son superiores al del gen de referencia Actina, mientras que, en las familias 102, 13, 17, 22, 30, 49, 56, 63 y 97 el gen de referencia Actina se expresa en mayor proporción que el gen NCED1. El ARN correspondiente a las muestras anteriores es del momento de la cosecha. Lo que permite dilucidar que la expresión del gen de interés es de menor proporción respecto al momento de postcosecha.

Se hizo un análisis agrupando las familias por la concentración Grays a las que fueros sometidas, donde se observa la diferencia en la cantidad relativa de cambios de expresión ente el gen normalizador y el gen objetivo, se nota una mayor expresión del gen NCED1 en las familias del tratamiento de 50Gy (Grafica 20). En el tratamiento de 25 Gy se puede apreciar que la expresión del gen de referencia es va desde 0 a 1, mientras que en el gen de interés va desde 0 a 0.94, valores inferiores respecto a los del tratamiento de 50Gy, ya que el gen de referencia actina va desde 0 hasta 0.6 mientras que NCED1 el gen de interés va hasta 1, se debe tener en cuenta que esta cuantificación relativa se hace con referencia al punto 0 considerando el error estándar de la media. Se hizo el cálculo del ∆∆CT asumiendo que tanto los genes de referencia como los de interés tienen la misma eficiencia de amplificación y se puede determinan el nivel de inexpresión de la diferencia relativa del gen objetivo en diferentes muestras siguiendo los pasos a continuación (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006):

Se obtuvo la gráfica 21 a partir del análisis de expresión génica mediante expresión normalizada ∆∆CT para las muestras del gen objetivo NCED1, en los momentos de cosecha y postcosecha, con unos datos ilustrados con relatividad al control. El tipo de error considerado es la desviación estándar (SD), la cual proporciona una idea una idea de la magnitud de diferencias entre las medias, debido a que se puede observar cuán grande es la diferencia en relación con el SD, permitiendo observar cuan grande es el tamaño del efecto.

Gráfica 21 Grafica de expresión normalizada ∆∆Ct, relativo al control, con tipo de error SD.

Primero, se normaliza el CT del gen objetivo al del gen de referencia, como se especifica en las siguientes ecuaciones:

∆CT (prueba) = CT (objetivo, prueba) - CT (ref, prueba) ∆CT (calibrador) = CT (objetivo, calibrador) - CT (ref , calibrador)

Segundo, se normaliza la ∆CT de la muestra de prueba a la ∆CT del calibrador:

∆∆CT = ∆CT (prueba) - ∆CT (calibrador) Por último, se calcula la relación de expresión:

2 – ∆∆CT = relación de expresión normalizada

Ecuación 3 cálculos ∆∆CT para obtener la relación de expresión normalizada toma de

Para las muestras cosecha se observa una cuantificación relativa que inicia en el valor 0.2 hasta el 1, siendo un rango menor al de las muestras de postcosecha que presentan un valor de 1 a 3.6, evidenciado un rango mayor o una mayor expresión en el momento de post cosecha.

Organizando los datos de ∆∆CT donde se evidencia el cambio normalizado de la cantidad de expresión, se compararon las muestras con el gen de interés NCED1, teniendo en cuenta las familias sin irradiación vs las muestras con el mismo gen con irradiación. En la grafica 22 se puede observar que en el momento de la cosecha la expresión del gen en las familias irradiadas como en las no irradiadas es similar, los que difiere en el momento de postcosecha, mostrándose una diferencia en la expresión de las familias con irradiación, ya que el bloque respectivo se ubica entre los valores de 1 a 3.8. El bloque correspondiente a las familias de este último sin irradiación exhibe una expresión menor pues sus rangos van desde cercano a cero hasta 1. Sin embargo al realizar el ANOVA con los valores de expresión relativa entre los tratamientos de 50 GY y 25 GY (Anexo I) se obtiene que las diferencias no son significativas, lo que sugiere que se debe ampliar la cantidad de muestras evaluadas para próximas investigaciones.