Lisis celular y extracción de componentes subcelulares y precipitación RNA total

ARN total de buen rendimiento y calidad. Las células vegetales poseen una pared celular compuesta de celulosa la cual representa el primer obstáculo para obtener ácidos nucleicos purificados, Dicha pared se debe romper por acción mecánica, pulverizando el tejido con nitrógeno líquido y maceración. De forma inmediata, se deben destruir las membranas celulares de manera que los ácidos nucleicos, acompañados de otros compuestos (proteínas, enzimas, carbohidratos), queden disponibles para su posterior procesamiento. Para conseguir esto se utilizan fuertes soluciones de sales caotrópicas. Estas soluciones de lisis, de baja o alta fuerza iónica y de altas concentraciones de cloruro de litio destruyen eficientemente las membranas celulares e impiden la actividad de las RNasas. En esta primera etapa se emplean los agentes quelantes, como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), para proteger los ácidos nucleicos de la acción de enzimas nucleasas. Los agentes quelantes capturan los iones y no permiten que actúen como cofactores de estas enzimas. Las altas concentraciones de LiCl se utilizan para prevenir la contaminación de las muestras con polisacáridos que afectan la pureza de los ácidos nucleicos (Rojas, Portal, & Jiménez, 2011)

El cloruro de litio (LiCl) a determinadas concentraciones es muy eficiente para precipitar el ARN total e ineficiente para precipitar otras moléculas como el ADN, proteínas y carbohidratos. Para eliminar el ADN que resulta como contaminante en la muestra después de la precipitación se realiza una digestión con la enzima desoxirribonucleica la cual rompe los enlaces fosfodiéster del ADN. Esta es eliminada posteriormente con un volumen de fenol:cloroformo y 1/10 de acetato de sodio, la enzima pasa a la fase orgánica por centrifugación quedando el ARN total en la fase acuosa por tal razón en el protocolo de extracción se tiene en cuenta la fase acuosa obtenida en varios de los pasos del protocolo (Rojas, Portal, & Jiménez, 2011).

Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1) es ideal para la extracción de proteínas en preparaciones de DNA y RNA. Es importante el uso de fenol estabilizado y equilibrado con un pH alto (pH aprox. 7.5 - 8.0). A valores de pH bajos (pH <6), el ADN se retendrá en la fase orgánica y en la interfase, dejando el ARN en la fase acuosa. La concentración de sal no debe permanecer por debajo de 50 mM, porque los oligómeros, en particular, pueden perderse en la fase de fenol. Si la concentración de sal es alta, puede ocurrir una inversión de la fase orgánica y acuosa. La

adición del antioxidante 8-hidroxiquinolina facilita la identificación de la fase orgánica por su color amarillo brillante y tiene las ventajas adicionales de reducir la velocidad de oxidación del fenol y la inhibición parcial de las ribonucleasas. Para mejorar la disociación de las proteínas de los ácidos nucleicos, que es el objetivo fundamental de una extracción con fenol, se ha demostrado que el uso de cloroformo junto con el fenol aumenta el rendimiento de los ácidos nucleicos. El cloroformo desnaturaliza las proteínas y mejora la separación de las fases orgánica y acuosa. Otras ventajas son la eliminación de lípidos por cloroformo y la reducción de la cantidad de agua retenida en la fase orgánica. El fenol tiene una vida útil muy limitada y su estabilidad se reduce adicionalmente con un pH alto. Su 'calidad' se puede controlar mediante un cambio de color de incoloro a rosa / rojo. Dichas soluciones de color rosa / rojo no deben usarse, ya que los productos oxidados del fenol pueden conducir a la ruptura de cadenas de ácidos nucleicos (PanReac AppliChem ITW Reagents©, 2019).

8.4 Cuantificación ADN Y ARN.

Una vez extraído el ADN y ARN (Anexo F) se cuantifico la concentración de ácidos nucleicos en el nanodropC 2000, donde también se evalúa la pureza de la extracción en la relación 260/280 y

Gráfica 9 Relación Curvas de cuantificación ADN, por el equipo NanoDrop2000. Tabla de muestras C:1 y 2 T1: 3 y 4

260/230 cuando el valor para la primera relación es de 1,8 a 2,0 para ADN, se considera optimo cuando el valor es inferior a 1,6 indica contaminación por presencia de compuestos aromáticos. En la Figura 37 se observa los valores de la cuantificación de extracciones de hoja de Solanum tuberosum, las muestra 1 y 2 (C) corresponden al control, 3 y 4 (T1) tratamientos de 25 Gy y 5 y 6 (T2) tratamientos 50 Gy. Como se observa en la tabla inmersa en la Figura, los valores se encuentran en el rango de muestra favorables. Para las extracciones de ARN se cuantifico con el equipo NanoDrop2000, pero configurado para muestras de ácidos ribonucleicos (ARN), en este caso las relaciones 260/280 y 260/230 cambian. Donde el valor 260/280 debe tener un valor de 2.0 a 2.2 para muestras optimas, Cuando el valor es inferior a 1,7 se considera que hay presencia de compuestos aromáticos. Para el caso del valor 260/230 cuando es inferior a 1,5 presenta contaminantes por sales, carbohidratos y fenoles.

Se realizo cuantificación de ARN usando el fluorómetro Qubit® 3.0, que mide ADN, ARN y proteínas utilizando los análisis de cuantificación altamente sensibles. La concentración de la molécula objetivo en la muestra se informa mediante un tinte fluorescente que emite una señal solo cuando se une al objetivo, lo que minimiza los efectos de contaminantes, incluido el ADN o ARN degradado, utilizando procedimientos de ensayo rápidos y simples. Los cálculos y ajustes se realizan automáticamente por el instrumento el cual puede guardar los datos para hasta 1,000 muestras, con facilidad de transferencia de los mismos. Los tintes fluorescentes que son específicos para el objetivo de interés. Estos tintes fluorescentes emiten solo cuando se unen a las moléculas diana, incluso a bajas concentraciones. El fluorómetro Qubit es más sensible que la absorbancia UV, que mide cualquier cosa que absorba a 260 nm: ADN, ARN, proteínas, nucleótidos libres o sales en exceso. Además, la espectrofotometría UV a

menudo no tiene la sensibilidad para medir con precisión bajas concentraciones de ADN y ARN (ThermoFisher Scientific, 2019). La cuantificación por medio de este instrumento representa una herramienta para la cuantificación optima de ácidos nucleicos. En la siguiente gráfica se pude apreciar la fluorescencia según las concentraciones en ng/μL, la recta se obtiene a partir de la

lectura de dos estándares; uno de alta concentración (1805 _{Gráfica 10 Cuantificación por medio de Fluorometro}

ng/μL) y uno de baja concentración (41,95 ng/μL). Los valores calculados por el equipo son presentados en su interfaz como una regresión lineal, el usuario debe construirla con los datos exportados del Quibit.