RT-qPCR

Debido a que la PCR convencional no permite cuantificar de forma precisa el producto que se amplifica. Es necesario el desarrollo de la PCR en tiempo real, que basándose en el mismo principio de la PCR, la PCR en tiempo real permite medir el material amplificado en cada ciclo, a través de la detección de fluorescencia que se emite cada vez que se lleva a cabo la síntesis de una nueva cadena (Primrose & Twyman, 2006). La PCR en tiempo real genera ampliaciones a partir de muestras muy pequeñas (desde 60 pb) siendo ideal para la detección de cambios cuantitativos en la expresión génica, como la cuantificación de estados de ARNm en muestras de tejidos con ARN particularmente degradado (Bustin, 2002).

Para entender cómo funciona una RT-PCR es importante examinar un ejemplo de la gráfica de amplificación (figura 10). En esta se relaciona el número de los ciclos de la PCR el cual es mostrado en el eje X y la fluorescencia de la reacción de amplificación, la cual es proporcional a la cantidad de producto amplificado en el tubo, esta es mostrada en el eje Y. La gráfica de amplificación muestra dos fases, una fase exponencial seguida por una fase no exponencial de la meseta. Durante la fase exponencial, la cantidad del producto de la PCR es aproximadamente el doble en cada ciclo, según la reacción procede. Sin embargo, los componentes de la reacción son consumidos y finalmente uno o más de los componentes comienzan a limitarse, en este punto, la reacción baja y entra en la fase no exponencial de la meseta (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006).

Inicialmente la fluorescencia permanece en niveles inferiores y aumenta en fluorescencia que no es detectable (ciclos 1 – 18), incluso aunque el producto se acumule de manera exponencial. Finalmente, el suficiente producto se acumula para producir una señal fluorescente detectable. El número del ciclo en el cual esto ocurre es llamado threshold cycle, o CT. Desde que el valor CT es medido en la fase exponencial cuando los reactivos no son limitados, la PCR en tiempo real puede ser usada de forma fiable y precisa para calcular la cantidad inicial de la plantilla presente en la reacción. El CT de una reacción es determinado principalmente por la cantidad de plantillas presentes en el inicio de la reacción de amplificación. Si una grande cantidad de la plantilla está presente en el comienzo de la reacción, relativamente pocos ciclos de amplificación serán requeridos para acumular suficiente producto para dar una fluorescencia sobre el fondo. Así, la reacción tendrá un bajo o temprano CT. En contraste, si una pequeña cantidad de plantilla es presente al comienzo de la reacción, más ciclos de amplificación serán requeridos para que la señal fluorescente se levante sobre el fondo. En consecuencia, la reacción tendrá una alto o tardío CT. Esta relación forma la base del aspecto cuantitativo de la PCR en tiempo real (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006).

El CT es elegido por el usuario de la fase exponencial en donde la cantidad inicial de moléculas del gen de interés presentes en una muestra es inversamente proporcional a la intensidad de fluorescencia. El CT permite discriminar el comportamiento de las muestras, ya que a un menor

Gráfica 1 Amplificación. Línea de base de fluorescencia. Tomado de Bio-Rad

valor de CT existe mayor cantidad inicial de moléculas del gen de interés en una muestra. El CT lo determina un software a un umbral de fluorescencia fijo (threshold) seleccionado por el analista, Estos valores pueden relacionarse con una curva estándar para determinar la cantidad de moléculas de ADN existentes (cuantificación absoluta) (López de la Mora & Sandoval Rodríguez, 2013).

7.10.1 Cuantificación por medio de RT-PCR

La cuantificación por medio de la RT-PCR, puede ser de dos formas; la primera es la cuantificación absoluta que consiste en la comparación de los valores de CT de las muestras del ensayo que componen la curva estándar. El resultado del análisis es la cuantificación de ácidos nucleicos (números de copias, microgramos) para cada cantidad obtenida (por célula, por microgramo de RNA total). La segunda es la cuantificación relativa, donde el análisis es un radio: la cantidad relativa de un ácido nucleico objetivo de la equivalencia con cantidades de las muestras del ensayo A vs B. En ambos casos se necesita direccionar la pregunta de cuál es “la cantidad de muestra”. (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006).

En la cuantificación absoluta (Ejemplo: número de copias por unidades de masa) de una muestra desconocida o muestra problema se interpola un rango de estándares de concentración conocida. Para construir una curva estándar es requerida la dilución de la plantilla de estándares. Las muestras problemas o desconocidas son montadas en el ensayo con los estándares en la misma corrida experimental. La curva estándar construida de la plantilla de dilución es usada para determinar la cuantificación del objetivo en la muestra desconocida por interpolación (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006).

Una curva estándar se constituye con el logaritmo del número inicial de estándares trazado a lo largo del eje x y sus respectivos valores CT trazados a lo largo del eje y. Basados en la ecuación de la regresión lineal, podemos derivar el seguimiento de la ecuación para determinar la cuantificación de una muestra desconocida.

Ecuación 2 Ecuación de cuantificación

de una muestra desconocida, obtenido de (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006)

Las aplicaciones más comunes de la RT-PCR que emplea cuantificación absoluta incluye determinación del número de copia de cromosoma o gen y determinación de carga viral. Este método de cuantificación es conceptualmente simple y las matemáticas del análisis es fácil de realizar. El método, sin embargo, requiere una fuente real de plantilla de concentración conocida y de estándares, los cuales deben ser amplificados en paralelo con la muestra cada vez que el experimento se realice (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006).

La cuantificación relativa o comparativa mide el cambio relativo en los niveles de expresión de ARNm. Determina cambios en los niveles de ARNm en estado estable de un gen en múltiples muestras y lo expresa en relación con los niveles de otro ARN. No requiere una curva de calibración estándar y la referencia puede ser cualquier transcripción siempre y cuando se conozca su secuencia (Bustin, 2002 citado por Pfaffl, 2019). Es la herramienta adecuada para investigar pequeños cambios fisiologicos en los niveles de exprecion genica. Usualmente los genes que se expresan de manera constante se eligen como genes de referencia que pueden coamplificarce en el mismo tubo en un ensayo multiplexado (controles endogenos) o en tubos separados (control exogeno) (Wittwer et al., 2001; Livak, 1997, 2001; Morse et al., 2005 citado por Pfaffl, 2019). Múltiples posibilidades son obvias para comparar la expresión del ARNm de un gen de interés con uno de los siguientes parámetros: según Pfaffl, 2019, una expresión génica puede ser relativa a: Un control endógeno, por ejemplo. un gen de referencia expresado constantemente u otro gen de interés un control exógeno; un ARN o ADN de control universal o artificial; un índice genético de referencia (consiste en múltiples controles promediados de endogeno); un índice genético objetivo (Consistente en promedios del gen de interes analizados en el estudio) (Pfaffl, 2019).

Para la cuantificacion relativa es usual el uso de un gen de referencia, cuya ventaja es que este metodo evita la necesidad de cuantificar y cargar con precision el material de partida. Este metodo requiere la disponbilidad de un gen de referencia conocido de expresion constante en todas las muestras analizadas y cuya expresion no cambie por el estudio de tratamiento (Pfaffl, 2019). Cuando se analizan múltiples muestras mediante una cuantificación relativa, una de las muestras se elige usualmente como calibrador, y la expresión del gen objetivo en todas las demás muestras se expresa como un aumento o una disminución con respecto al calibrador. Para determinar la expresión relativa de un gen objetivo en la muestra de prueba y la muestra del calibrador utilizando

uno o más genes de referencia para la normalización. Se pueden utilizar varios métodos para determinar el nivel de expresión del gen objetivo en la muestra de prueba en relación con la muestra de calibradores con los valores de Ct. Existen tres métodos para la cuantificación relativa usando un gen de referencia:

• El método Livak, también conocido como el método 2-∆∆CT.

• El método ∆CT usando un gen de referencia

• El método Pfaffl.

Cada método tiene ventajas y desventajas, así como suposiciones que deben cumplirse para que los resultados del análisis sean válidos (Bio-Rad Laboratories, Inc., 2006).