CAPÍTULO III Disposiciones Generales
DELITOS CONTRA LAS RELACIONES FAMILIARES
Môi trường sau khi được pha chế được phân phối vào các dụng cụ thích hợp tòng nghiệm, bình tam giác, hộp petri) tùy mục đích sử dụng trước khi được khử trùng.
Đế khảo sát các p h ản ứng sinh hóa, lên men, tiền tăng sinh, tăng sinh, môi trường dạng lỏng thường được chứa trong ô'ng nghiệm thủy tinh. Môi trường sau khi pha chế được phân phôi th à n h lượng thích hợp vào ống nghiệm bằng cách rót bằng phều thủy tinh, hút bằng ống hút cùng quả bóp cao su hoặc bằng ông h ú t tự động (pipetman) bằng tay hoặc dùng điện. Các ống nghiệm chứa môi trường lỏng được đậy bằng nút bông không thấm nước, nút silicon (khi nuôi cấy lắc), bằng nút nhôm, nút inox (nuôi cấy tĩnh).
Đê nuôi tiền tăng sinh, tãng sinh với dung tích ìớn, môi trường lỏng thường được chứa trong các bình tam giác. Môi trường được pha chế th à n h dung tích cần th iế t trực tiếp trong bình chứa hoặc được pha chế trong bình chứa lớn hơn, sau đó được đong bằng ông đong th à n h dung tích cần thiết và chuyển vào bình tam giác có dung tích cần nuôi cấy thích hợp. Các bình tam giác chứa môi trường này được đậy bằng nút bông không th ấ m hoặc bằng nút silicon.
Để khảo sát khả năng tàng trưởng, hình thái khuẩn lạc tr ê n môi trường chọn lọc hay p h ân biệt, để định lượng vi sinh vật... người ta thường nuôi chủng trê n môi trường rắ n trong đĩa petri. Các hộp petri chứa inôi trường rắ n được chuẩn bị bằng phương pháp đổ đĩa. Trong trường hợp này, môi trường rắ n được pha chế và đun tan trong bình tam giảc lớn. Binh này được đậy băng giấy nhôm (aluminum foil) hoặc bằng nút silicon (hạn chế đậy bằng nút bông vì làm tăng nguy cơ nhiễm khi rót môi trường). Trường hợp không có giấy nhôm hoặc nút silicon có th ể sử dụng giây dày, dai để bịt miệng bình và cột kỹ bằng dây thun. Sau khi khử trùng, môi trường được đổ vào các đĩa petri vô trùng khi đã nguội khoảng 45 - 55°C.
Để khảo sát các khả năng tă ng trưởng, tạo bào tử, một số thử nghiệm sinh hóa, cây chuyền, bảo quản giông, người ta thường sử dụng ống nghiệm chứa môi trường rắ n có m ặt môi trường nghiêng để tă n g diện tích bề m ặt môi trường (ông thạch nghiêng). Trong trường hợp này, môi trường rắn được chuẩn bị và đun ta n trong bình tam giác hoặc bình chứa lớn, sau đó được rót vào các ông nghiệm bằng phễu thủy tin h th à n h
nhừng phần từ 5 - 6ml. Miệng các ống nghiệm được đậy bằng nút bông
không th ấ m nước. Bề m ặ t thạch nghiêng dược tạo sau khi hấp khử trùng môi trường.
Đê nuôi cấv VI sinh vật kỵ khí, ông thạch sâu (ông thạch đứng) chứa
m ô i trư ờ n g r ắ n th ư ờ n g được sử dụ n g. O ng m ô i trư ờng n à y được ch u ẩ n bị
tương tự ống th ạch nghiêng nhưng với lượng môi trường nhiều hơn
{khoảng 1/2 ống nghiệm).
1.3. Khử tr ù n g d ụ n g cụ v à m ôi trư ờng
Về nguyên tắc có thể tiệ t trùng vi sinh vật bằng một sô' tác n h ân lý hóa như n h iệt độ, bức xạ, lọc và hóa chất. Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi sinh vật do tác dụng làm biến tính enzyme, m ất nước và ôxy hóa các th à n h p h ần của t ế bào; n h iệt độ thấ p ức chê sự tầng trưởng của chúng. Có thể khử trù n g bằng phương pháp nhiệt khô (sấy 170°c trong 2 giờ; đốt) hoặc n h iệt ẩm (đun ở 63°c trong 30 phút hoặc 72°c trong 15 phút để diệt vi sinh vật gây b ệnh hoặc vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm; đun sôi
100°c
trong 10 phút để diệt tế bào sinh dưỡng và hấp bằng hơi nước ở latm , 121°c trong 15 - 30 phút để tiệt trùng hoàn toàn). Năng lượng chiếu xạ ở bước sóng ngắn ítia X, tia gamma) có khả năng ion hóa phân tử nước tạo gốc tự do tác dụng phá hủy DNA, màng lipid, protein trong tế bào; tia xạ có bước sóng dài hơn như tia tử ngoại không có tác dụng ion hóa nhưng có thể cảm ứng việc tạo th à n h dimer giữa base pyrimidine (T, C) trong nucleic acid tạo nên (Jột biến, có thể gây chết tế bào. Các dịch lỏng có th ể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có kích thước giới h ạ n (0,2|im), cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tấ t cả vi khuẩn và các vi sinh v ật có kích thước lớn hơn. Nhiều hóa chất có thể kiểm soát sự tă n g trưởng của vi sinh vật. Ethylen oxide, triethylen glycol, chất diệt khưẩn, k h án g sinh... được sử dụng để khử trùng, ức chế sự sông và tă ng trưởng của vi sinh vật.Tác n h ân khử trù n g được chọn tùy mục đích và vật liệu cần khử trùng. Trường hợp cần khử trù n g môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương
pháp nhiệt ẩm bằng nồi hấp áp lực (ở 121°c, 15 - 30 phút) thường được
sử dụng để các th à n h p h ầ n hữu cơ của môi trường không bị cháy, biến tính và môi trường không bị m ất nước. Trường hợp môi trường chứa các chất p h ân tử lượng nhỏ không bền với nhiệt như vitamin, amino acid hoặc huyết th a n h chứa các protein là nhân tô' tă n g trưởng, phương pháp nhiệt ẩm có th ể làm biến tính các th à n h phần này, nên các th à n h phần này thường được khử trùng riêng bằng phương pháp lọc qua màng lọc vô trùng. Các dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường được khử trùng bằng phương pháp n h iệt khô trong tủ sấy. Các thanh gạt thủy tin h được
khử trùng bằng cách đôt với cồn 70° và các que cây kim loại được khử
trùng bằng cách đốt trực tiếp tr ê n ngọn lửa. 48
1.3.1. Khử trùng mỏi trường, dụng cụ bằng nồi hấp áp lực
Sau đây là phương pháp sử dụng nồi hấp áp lực để khử trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suât lớn hơn áp suất bình thường của khí quyến. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì n h iệt độ cũng tăn g theo. Phương pháp khử trùng bằng nhiệt ấm này cho phép diệt cả t ế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật. Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp lực như sau: Bổ sưng nước ở đáy nồi đến vạch quy định, x ế p dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá, không nên xếp quá chặt để hơi nước lưu thông dễ dàng. Đậy kín nắp nồi hấp. Mở van thông hơi nước giữa hai nồi (trường
hợp n ồ i h ấ p h a i lớp). B ậ t c ô n g tắ c Hình 4.1 Nổi hấp áp lực
điện, đun nồi hâp. Khi nhiệt độ lên
đến 80uc hoặc 0,5atm, mở từ từ van xả để đuổi h ế t không khí ra khỏi nồi
trong vòng 3 - 5 phút cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục, đóng
van lại. Khi áp suất nồi trong lên đến áp suất cần hấp bắt đầu tín h thời gian hấp. Khi đủ thời gian khử trùng, t ắ t điện, chờ n hiệt độ và áp suất
hạ xuông giá trị 0 mới được mở nắp để tránh gây tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư môi trường. Một sô" nồi hấp hiện đại có thể
tự kiểm soát thời gian, áp suất và tự đuổi khí ra khỏi nồi, cho phép bỏ qua một sô' thao tác tương ứng ở p h ần trên, Nồi hấp áp lực có th ể được thiết k ế đứng (nắp nồi ở phía trên) hoặc n ằm (nắp nồi ở bên hông).
Khi sử dụng nồi hấp áp lực dể khử trùng cần lưu ý những điểm sau
đây:
- Nồi hấp là thiết bị khử trùng bằng hơi nước, cần đảm bảo đủ nước
mới tiệt trùng tốt, m ặ t khác, thiếu nước sẽ làm cháy điện trở. Do vậy, cần kiểm tr a mực nước và bổ sung lượng nước cần th iế t trước khi sử dụng.
- Với nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần phải xiết ốc theo từng cặp đối xứng
để đảm bảo độ kín, tránh làm nắp bị chênh hoặc hư vòng đệm cao su. - Tuyệt đốì không mở nắp nồi khi kim chỉ nhiệt độ và áp suất chưa
Sau khi h ấp khử trù n g xong cần lấy sớm dụng cụ, bình chứa môi trường ra khỏi nồi h ấp và làm nguội n hanh n h ằm giảm thiểu tác dụng của n h iệ t lên môi trường. Các bình chứa môi trường có thế được làm nguội n h a n h dưới vòi nước chảy.
Các bình ta m giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi được khử trùng b ằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt nhưng đảm bảo cho phép không khí và hơi nước thông qua bằng một trong các phương pháp sau:
- Dùng nút bông không th ấ m nước, nút silicon, nắp nhôm (trường hợp môi trường sẽ được dùng đế nuôi cây vi sinh vật trong cùng vật chứa).
- Dùng giây nhôm (trường hợp môi trường được dùng để đổ đĩa petri, trường hợp nước và các dung dịch cần vô trùng khác).
Thông thường, các đĩa petri hoặc nut bông còn được bao gói bằng giây hoặc giấy nhôm đế giảm thiểu nguy cơ bị nhiễm sau khi khử trùng. Sau khi hấp, các đĩa petri vô trùng cần được sấy khô trước khi dùng.