Từ các khuẩn lạc nghi ngờ trê n môi trường phân lập, chọn ít n h ấ t 5 khuẩn lạc cấy lên môi trường không chọn lọc (như TSA), ủ ở 37°c trọng thời gian 20 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để tiến h àn h các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
- Thử nghiệm sàng lọc: trước tiên các dòng được nghi ngờ là Shigella được cấy vào môi trường TSI, ủ ở 37°c trong 24 giờ. Shigeỉỉa cho phản ứng kiềm trê n m ặt nghiêng và acid ở phần sâu, không sinh hơi và không tạo H2S trong môi trường. Các dòng có phản ứng như trê n được thử nghiệm để kh ẳng định Shigella.
- Thử nghiệm khẳng định: các thử nghiệm sinh hóa cần tiến h àn h để khẳng định Shigella và các đặc trưng sinh hóa của nhóm này được tóm tắ t như dưới đây. Chi tiế t quy trìn h thực hiện các thử nghiệm sinh hóa này được trìn h bày ở chương IV.
T h ử n g h iệm sin h h ó a K êt qu ả Simmon citrate - Arginine decarboxylase Lisine decarboxylase Urease - Malonate MR + VP
Các vi sinh vật có các phản ứng sinh hóa đặc trưng như trê n được khẳng định là Shigella spp- Để xác định loài Shigella nhiềm vào trong mẫu. cần thực hiện các phản ứng sinh hóa đặc trưng của từng loài như sau:
T h ử n g h iệm sìn h hóa K êt quả Salicine Xylose Cellobiose Adonitoỉ Dulcitol Inositol
Đ ặ c tr ư n g s in h h ỏ a s. d y s e n te r ỉa e s
.
fle x n e r i s. b o y d ii s.
so n n e ỉ Sinh khí từ glucose - - _ \) _1 p-galactose + /-lỉ - +/- + O rn ithin decarboxylase - - _1) + Indol + /-2) +/-2) _1) - Acid từ dulcitol 4) 4) _ - Lactose - 1) _1) +' M annitol - + + + Raffinose - +/- - + : Saccharose - - - +; Xylose - - + / - -l' Các dòng s. dysenteriae ỉ ưà s. sonnei ỉuỗn ỉuôn cho phản ứng dương tinh; S.clysenteriac 1 và s . flcxnen 6 luôn luôn cho phản ứng âm tính, s. dysenteriae 2 thì dương tinh; J> Phản ứng dương tinh chi biểu hiện 24 giờ sau nuôi cấy; 4>
s.
dysenteriae vàs.
flexneri 6 có thế cho phán ứng dương tính .6.3.5. Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh
Thực hiện thử nghiệm kháng huyết th an h bằng huyết thanh đa giá A, B, c , D từ các dòng được nuôi cấy trê n môi trường thạch không chọn lọc. Tiến h àn h các đối chứng (-) trê n nước muối sinh lý.
Một số Shigella tạo th à n h k h áng nguyên bề m ặt (kháng nguyên K) có th ể làm che m ấ t k h án g nguyên o và làm cho phản ứng ngưng kết không diễn ra. Vì th ế khi không có biểu hiện ngưng kết, cần thực hiện việc đun sôi dịch vi khuẩn trong khoảng 30 phút để loại bỏ kháng nguyên bề m ặt. Sau đó tiên h à n h lại thử nghiệm ngưng kết.
6.4. Báo cáo k ết quả
Kết quả được báo cáo dưới dạng phát hiện hay không p h át hiện Shigella trong 25g mẫu.
Cần lưu ý Shigella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm , có th ể gây các triệu chứng b ện h ở m ật dộ xâm nhiễm r ấ t thấp. Do vậy cần tuân thủ triệ t để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salm onella dùng làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trê n các chủng p hân lập được. Các môi trường hay mẫu v ật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trù ng cẩn th ậ n trước khi rửa.
Quy trìn h p h á t h iệ n và định danh Shigella trong thực phẩm được tóm tắ t trê n H ình 5.7.
Hình 5.7 Quy trình phát hiện và định danh Shigella trong thực phẩm
7. V IB R IO
7.1. Định nghĩa và ngu yên tắc
Vibrio là vi sinh v ật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo th à n h hình dấu phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S, nhạy
cam với V ibriostaticum 0/129. Trừ V. cholerae hiện diện ở vùng nước ngọt, tấ t cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường xuyên được p hân lập dược từ các vùng nước ven biển. Giông này có 4 loài là tác n h ân gây bệnh cho người gồm: V. choỉerae, V. parahaem olyticus, V. vulnificus và V. alginolyticus được phán biệt dựa trê n các đặc điểm sau đây:
V. chulerae có p hản ứng oxidase (+), tăn g trưởng được trong môi
trường canh trypton ở 42°c, arginine dehydrolase (-), lysine
decarboxylase ( + ), lên m en được sucrose (saccharose), khử n itrate th à n h nitrite, có thể tă n g trương được trong môi trường chứa 0 - 3C'C NaCl, không phát triể n được trong các môi trường chứa 6,8, 10% muối.
V. parahaemoỉyticus có phản ứng oxidase ( + ), phát triển được trong canh trypton ở 24°c, p h ản ứng ADH (-), LDC ( + ), có khả năng khử n itra te th à n h n itrite nhưng không lên men sucrose, sử dựng được một sô” nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, khỏng tăng trướng được trong môi trường không có muôi, tăng trưởng tốt. trong
môi trường có đến 8% muôi nhưng bị ức chế trong môi trường chứa
10% muôi.
V. vulnificus khác với hai loài nêu trên là không lên men sucrose, không tăn g trưởng được trong môi trường không có muôi, bị ức chế trong môi trường có 8 - 10% muôi.
V. alginolyticus có khả năng lên men đường sucrose, không tăng trưởng được khi trong môi trường không có muối nhưng có th ể p h át triển
trong môi trường chứa đến 10% muối
Có th ể p h át h iện các loài Vibrio dựa trê n nguyên tắc sau đây: Một lượng mẫu xác định được tă n g sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cây p hân lập từ môi trường tăn g sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ trê n môi trường phân lập được khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết th a n h học. Môi trường tă n g sinh chọn lọc cho Vibrio choỉerae, V. aỉginolyticus và V. vulnificus là nước pepton kiềm. Trong khi đó môi trường Colistine Polymicine B roth thường được dùng để tă n g sinh V. parahaemolyticus. Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosulphate C itrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật lên men được sucrose trong môi trường này sè cho khuẩn ỉạc màu vàng và làm acid hóa môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nêu vi sinh v ật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc m àu xanh.
7.2. Môi trường và hoá chất
- Canh Pepton kiềm Alkaline Peptone W ater (APW) - Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine)
- Thạch Thiosulphate C itrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar) ~ Canh Tryptone
- Thạch Kligler Iron (KI)
- Canh Hugh Leifson Glucose (HLG) - Canh Carbohydrate tím
- Môi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller) - Dung dịch oxidase
- Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%) - Kháng huyết th a n h polyvalent o dùng cho V. choỉerae
- K háng huyết th an h o - Dung dịch NaOH IN - Dung dịch HC1 IN - Dung dịch dầu phủ vô trùng - Dung dịch Bromocresol tím 7.3. Quy trìn h p h â n tích 7.3.1. T ổ n g s in h c h ọ n lọ c
Cân 25g mẫu vào trong bao PE vô trùng, thêm 225 ml canh thang tăn g sinh chọn lọc (dùng nước pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V. cholerae, V. vulnificus, V. alginolyticus; canh Colistine cho trường hợp V. parahaem oỉyticus). Đồng n h ấ t mẫu bằng máy dập mẫu. u ở
37°c trong 6 - 8 giờ.
7.3.2. Phản Ịập
Dùng que cấy vòng ria váng trê n bề m ặt môi trường tăn g sinh chọn lọc lên bề m ặt đĩa th ạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37°c trong 18 - 22 giờ. H ình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trê n môi trường này là như sau: Khuẩn lạc V. cholerae và V. aỉginolyticus lớn, đường kính khoảng 2 - 3mm, láng, có màu vàng, hơi phẳng, tâ m đục và chung quanh khuẩn lạc có quầng trắn g dục (X. ảnh 28). K huẩn lạc V. parahaemoỉyticus và V. vulnificus lớn, đường kính khoảng 3 - 4mm, có màu từ xanh đến xanh dương. Tiếp theo, cấy chuyền sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trê n môi trường p h ân lập sang môi trường không chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ồ n h iệ t độ 37°c để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa.