CAPÍTULO VI De las defraudaciones
SECCIÓN 1ª De las estafas
8.1. Định nghĩa và nguyên tắc
L. monocytogenes là vi khuẩn có hình gậy ngắn, m ảnh, gram dương sau khi nuôi cấy 20 giờ. cho thử nghiệm catalase ( + ), oxidase (-), chuyến động xoay tròn th àn h đợt trong tiêu bản giọt treo (khi nuôi cấy ở 20 -25°C), có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trê n môi trường thạch, máu, sinh acid từ rham nose nhưng không xylose, có phản ứng CAMP ( + ) với Staphylococcus aureus và (-) với Rhodococcus equì. L. monocytogenes là một tác n h ân gây bệnh listeriosis rấ t nguy hiểm (nhiễm trùng máu, sẩy thai ở phụ nữ, viêm màng não, gây tử vong thai nhi) có tỉ lệ tử vong rấ t cao {30 - 35c/c ở người ìớn và 70% ở trẻ em). Loài này thường được phát hiện trong thức ăn gia súc, nước, nước thải, là loài đặc biệt nguy hiểm trong các loại thực phẩm đã qua gia nhiệt. Các quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm thường không cho phép sự hiện diện của L. monocytogenes trong 25g thực phẩm đã qua gia nh iệt nhưng cho phép 100 CFU/g đôì với thực phẩm phải gia n h iệt trước khi sử dụng.
Quy trìn h p h át hiện L. monocytogenes được thực hiện bằng quá trìn h tăng sinh 2 giai đoạn. Mẩu được cân vào trong túi PE vô trùng, đồng n h ất với môi trường tăn g sinh sơ cấp. Sau khi ủ 24 giờ, dịch nuôi cấy được chuyển vào môi trường tă n g sinh thứ cấp và được ủ tiếp 24 giờ. Hiện nay quy trìn h cải tiến cho phép tăng sinh một giai đoạn nhưng thời gian tăng sinh là 48 giờ. Quy trìn h tăng sinh một giai đoạn được sử dụng khi các mẫu có m ật độ vi sinh vật nhiễm thâp; quy trìn h tăng sinh hai giai đoạn được sử dụng cho các mẫu có m ật độ vi sinh v ật nhiềm cao. Sau bước tăng sinh, canh khuẩn được chuyển sang bước phân lập trên môi trường chọn lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa và miễn dịch bằng các thử nghiệm đặc trưng. Trong p h át hiện L. monocytogenes cần sử dụng các chủng vi sinh vật làm đối chứng như: L. monocytogenes, L. innocua, S. aureus dung huyết [3 yếu, R. equi.
8.2. Môi trường và hoá ch ất
- Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichm ent Broth I (LBI)
- Canh tầ n g sinh th ứ cấp Listeria Enrichm ent Broth II (LBII) được chuẩn bị th à n h các ông nghiệm 10ml
- Môi trường Enrichm ent Broth (EB) cải biên từ môi trường LB, được sử dụng trong quy trìn h tăn g sinh một giai đoạn
- Môi trường th ạch Oxford Agar - Thạch máu
- Môi trường thạch mềm BHI: BHI chứa 5g agar/1, phân phối 5ml vào trong các ống nghiệm
- Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR) - Thuốc thử catalase, oxidase
8.3. Quy trình phân tích
8.3.1. Tăng sinh
Đồng n h ấ t 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh LBI bằng Stom acher trong 30 giây, ủ 30°c trong 24 giờ. Chuyển 0,1 ml LBI sang ông 10 ml LBII tiếp tục ủ ở 30°c trong 24 giờ. Quy trìn h tăn g sinh một giai đoạn được thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB (đà được làm ấm ở 45°c nếu mẫu thử là các sản phẩm của sữa và ở 30°c đối với các sản phẩm khác) và tiến h àn h đồng nhâ't mẫu trong 30 giây. Ư ở 30°c trong 48 giờ.
8.3.2. Phân ìập
Dùng tăm bông vô trùn g th ấ m dịch mẫu từ ông tăn g sinh, trả i sang
1/2 đĩa môi trường Oxford Agar. Từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang 1/2 đĩa còn ỉại. u ở 37°c trong 24 - 48 giờ. Trên môi trường này khuấn lạc Listeria có màu xám hay nâu được bao quanh bởi vòng đen,
k h u ẩ n lạ c lõ m , n h ỏ , đường k ín h k h o ả n g lra m (X. ảnh 29).
8.3.3. Khẳng định
- Thử khả năng ta n huyết: chọn khuẩn lạc điển hình trê n môi trường thạch Oxford, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường thạch máu, ủ ở 37°c trong 24 - 48 giờ. Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc L. monocytogenes được bao quanh bởi vòng tan huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng [3. Trước khi tiến h àn h thử khẳng định, cấy chuyền khuẩn lạc nghi ngờ L. monocytogenes sang một môi trường lỏng không chọn lọc, ư ở 25°c trong 20 giờ.
- Thử nghiệm catalase và oxidase (xem chương IV): L. monocytogenes có catalase (.+) và oxidase (-).
- Nhuộm gram: Listeria nhuộm gram dương.
- Khả năng đi động phương pháp giọt treo: Listeria spp. chuyến động xoay trò n trong canh trù ng ủ ở 25°c. Thử tín h di động trong ống nghiệm: cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong ống nghiệm , ủ 25°c trong 40 giờ hoặc lâu hơn, kiểm tra sự tăn g trưởng của vi khuẩn xung quanh đường cấy, Listeria spp. di động tạo hình chiếc dù cách bề m ặt thạch vài mm.
Khả năng biên dưỡng đường: ủ các ông canh trùng thử khả năng len men đưong ớ 37 °c trong 7 ngày. Kêt quả (+) (màu vàng) thường quan sát được trong vòng 24 - 48 giờ. L. monocytogenes iên men đường rhamnose nhưng không có khả năng lên men đường xylose.
- Thử thử nghiệm CAMP: trên đĩa thạch dùng để thử CAMP, cấy
s.
aureus th à n h một đường cấy mỏng, tương tự cấy R. equi để tạo th à n h hai đường cấy song song cách nhau 4 cm {Hình 5.9).Hình 5 .9 Sơ đồ phân bố đường cấy các chủng trong thử nghiệm CAMP
Cấy chủng nghi ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai đường cấy song song của s. aureus và R. equi. Có thế cây m ột hoặc nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ L. monocytogenes (chủng thử nghiệm) để kiểm tra trên cùng m ột đĩa. c ấ y chủng đối chứng (+) L monocytogenes và chủng L. innocua như hướng dẫn trê n H ình 5.9.
u
đĩa ở37°c
trong 20 - 36 giờ. P hản ứng (+) khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ran h giới của chủng th ử nghiệm với 5. aureus hoặc giữa chủng thử nghiệm với R. equi. P h ản ứng CAMP (+) với R. equi sẽ tạo vùng ta n huyết rộng (5 - 10 mm) và có hình dạng đầu mũi tên. P hản ứng (+) với s. aureusthường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn.
L. monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với s. aureus và (-) với R. equi. Ngược lại L. innocua có phản ứng CAMP (~) với cả hai loài s. aureus và R. equi.
8.4. Báo cáo k ết quả
Báo cáo p h á t hiện hoặc không p h át hiện L. monocytogenes trong 25g mẫu. Quy trìn h p h át hiện L. monocytogenes được tóm tắ t trê n H ình 5 .lồ.
Hình 5.10 Q uy trình phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm
Cần lưu ý L. monocytogenes là tác nhân gây bệnh đặc biệt nguv hiểm. Người đang mang thai, người suy yêu hệ miễn dịch... không được trực tíêp làm việc với vi khuẩn này. c ầ n th ậ n trọng và tuân thủ nghiêm ngặt các quy định an toàn khi thao tác trên vi sinh vật gáy bệnh khi tiến hành phân tích thử nghiệm Listeria. Nêu có điều kiện nên phân riêng khu vực dành cho phân tích Listeria. Các môi trường hay dụng cụ sau khi nuôi cấy phải được hấp khử trùng trước khi rửa hay thải bỏ.