DENDRÍMEROS EN TERAPIA GÉNICA

La terapia génica consiste en la introducción de genes en las células portadoras de enfermedades para tratar de sustituir material genético defectuoso por uno funcional. Actualmente el método más usado para el transporte de material genético es el uso de vectores de tipo viral, debido a su gran eficacia.58-60 Sin embargo, el uso de virus para introducir ácidos nucleicos dentro una célula no está exento de riesgos, ya que también poseen numerosas desventajas: pueden ser tóxicos, carecen de especifidad celular y pueden inducir respuesta inmune en los pacientes. Esto ha provocado un gran interés en el descubrimiento de nuevos vectores no virales que puedan servir como alternativa a los virus como nuevos vehículos de transporte. Debido a que estos transportadores han de ser sintetizados se puede seleccionar y modificar todos los aspectos que los componen, desarrollando las características que más convienen para este fin. Sus ventajas principales son que presentan una gran flexibilidad con respecto al tamaño y naturaleza del material nucleico a transfectar y que no provocan una respuesta inmune por parte del paciente, propiedad importante en el caso de ser administrados de manera continuada.61-63

Los vectores no virales, generalmente suelen ser catiónicos, o con capacidad de cargarse positivamente a pH fisiológico, para de este modo, ser capaces de formar interacciones electrostáticas con el ácido nucleico a transportar. Hasta ahora los vehículos de transporte no víricos que más se han estudiado son los liposomas, los polímeros convencionales y los dendrímeros.

1.6.1.1 Liposomas catiónicos

Los liposomas catiónicos están constituidos por una bicapa lipídica que a su vez, están formadas por cadenas lipídicas unidas a una cabeza polar, con la que es capaz de formar interacciones electrostáticas con otras sustancias.64,65 Este tipo de fosfolípidos se ensamblan orientando las partes polares de su estructura hacia un hueco acuoso interno y hacia el medio acuoso exterior, dejando las partes apolares en una zona interna alejada del medio fisiológico.

Los liposomas catiónicos presentan ciertas ventajas como por ejemplo:

• Protegen al material nucleico de la degradación hasta su llegada al núcleo.

• Poseen un tamaño modulable, lo que les confiere una gran versatilidad con respecto al tamaño del ADN que pueden transportar.

• Es posible incluir en su estructura receptores específicos de la membrana lipídica, lo que hace que puedan ser dirigidos a tejidos de forma selectiva.

• No son tóxicos ni generan respuesta inmune en el paciente.

Los liposomas catiónicos no están exentos de desventajas, ya que las zonas apolares de sus estructuras les confieren una cierta insolubilidad y en presencia de suero baja su eficacia debido a interacciones con proteínas que éste contiene (Figura I.5).

Figura I.5. Liposomas catiónicos.

1.6.1.2 Polímeros catiónicos

Otro de los vectores más utilizados en terapia génica son los polímeros lineales catiónicos.

Los polímeros de polilisina fueron de los primeros en utilizarse para el transporte de ADN. Son péptidos de gran tamaño formados por unión de monómeros del aminoácido lisina que se cargan positivamente a pH fisiológico. Además, este tipo de estructuras son degradables lo que impide que se acumulen en el organismo. Sin embargo, estos polímeros se caracterizan por poseer una toxicidad alta.

Uno de los polímeros utilizados en sustitución de los polímeros de polilisina fueron las polietileniminas (PEI), que poseen una menor toxicidad que las polilisinas y también poseen una mayor eficacia en la transfección del material nucleico al interior celular, pero que no tienen una estructura totalmente definida, además de una alta polidispersidad, lo que se traduce en grandes inconvenientes. Estos polímeros están formados por unidades de polietilenimina y al igual que los polímeros basados en lisina se protonan en medio acuoso (Figura I.6).66,67

Figura I.6. Polímeros catiónicos

1.6.1.3 Dendrímeros catiónicos

A diferencia de otro tipo de estructuras utilizadas para el transporte de ácido nucleicos, los dendrímeros destacan por ser monodispersos, es decir sus estructuras poseen un tamaño y peso molecular bien definido, son estables y además tienen una relativa baja viscosidad a pesos moleculares altos. Estas características convierten a los dendrímeros en candidatos ideales para el transporte de material genético dentro del organismo.

En 1993 Haensler y Szoka fueron los primeros en demostrar que un fragmento de ADN que contiene el gen de la luciferasa y de la β-galactosidasa podía ser internalizado dentro de las células usando dendrímeros PAMAM, constatando una mayor eficacia en la transfección cuando la relación de cargas era de 6:1 (grupos amonio:fosfato), con dendrímeros superiores a la tercera generación.68 Posteriormente, en 1996, Roberts y colaboradores realizaron un estudio utilizando dendrímeros PAMAM de tercera, quinta y séptima generación, observando que a medida que aumentaba la generación crecía la toxicidad de éstos, tanto in vitro como

in vivo. En este estudio también se determinó que estos dendrímeros no generaban

respuesta inmune, y se observó que dependiendo de la generación los dendrímeros se distribuían en distintos órganos.69

La estabilidad de los sistemas formados por dendrímeros PAMAM y oligonucleótidos (fragmentos de ADN de menor tamaño que los plásmidos) antisentido fue evaluada por Juliano y colaboradores, confirmando lo que habían determinado estudios anteriores, la unión de las estructuras dendriméricas con material genético presentaba una baja toxicidad y una gran capacidad de transfección.70

En los dendrímeros tipo PAMAM se ha demostrado que una degradación parcial por tratamiento térmico en agua y en algunos alcoholes, confiere una mayor eficacia en la transfección. Se cree que esta fragmentación proporciona a estos sistemas una mayor flexibilidad, en contrapunto a los dendrímeros de altas generaciones que poseen un gran impedimento estérico en su superficie, conocido como efecto paraguas (Esquema I.14).71,72 Hoy en día este tipo de derivados se comercializan con el nombre de Superfect©.

Esquema I.14. Activación de un dendrímero PAMAM.

Otros dendrímeros catiónicos que han sido analizados en fenómenos de transfección de material genético son los dendrímeros polipropilenimina (PPI). Estas estructuras han resultado ser más tóxicas y menos eficaces en la transfección que los dendrímeros PAMAM a igual generación.73,74 Sin embargo, a diferencia de los PAMAM, los dendrímeros PPI, son capaces de transfectar material genético a generaciones más bajas con mayor eficacia, con la ventaja añadida de que las generaciones más bajas son menos tóxicas que las generaciones superiores.75,76

Los dendrímeros basados en fósforo son otra clase de dendrímeros que han sido usados para el transporte de material genético. Majoral y colaboradores demostraron que este tipo de dendrímeros eran capaces de transfectar el gen de la luciferasa en células 3T3, y que a medida que aumentaba la generación, aumentaba la capacidad de transfección hasta alcanzar la tercera generación, a partir de la cual la capacidad de transfectar ADN se mantenía estable. Además, en este tipo de dendrímeros, a diferencia de los liposomas catiónicos, la presencia de suero beneficia

sus propiedades, disminuyendo su toxicidad y aumentando su capacidad de transfección.77

En nuestro grupo de investigación se han sintetizado varias familias de dendrímeros carbosilano catiónicos de diversas generaciones que son capaces de formar complejos mediante interacciones electrostáticas con fragmentos de material nucleico y son capaces de transportar estos fragmentos al interior celular. De estos dendrímeros se hablará en posteriores capítulos.

Aunque los dendrímeros aquí descritos son los sistemas más utilizados en el transporte de material genético al interior celular, existen muchos otros ejemplos de dendrímeros con diversos tipos de esqueleto diseñados al respecto, como por ejemplo dendrímeros de polilisina,78 de triazina,79 lípidos,80 etc.