TIPOS DE DENDRÍMEROS UTILIZADOS EN TRANSFECCIÓN

Debido a los resultados prometedores obtenidos con el uso de estructuras dendriméricas como vectores de transfección de material genético en el interior de distintos tipos de células, en los últimos años ha habido una gran expansión en el número de familias de dendrímeros sintetizadas para tal fin. Sin embargo, son cinco las familias sobre las que se han realizado sistemáticamente más ensayos de transfección: PAMAM, PPI, Polilisina, PPH y CBS (carbosilano).

Dendrímeros poliamidoamina (PAMAM)

Como ya se ha comentado en los capítulos previos, los dendrímeros PAMAM fueron los primeros esqueletos dendríticos en estar disponibles comercialmente, lo que provoca que la amplia mayoría de publicaciones relativas a transfección de material genético utilizando dendrímeros como vectores estén realizadas con esta familia de dendrímeros.

Szoka y colaboradores fueron los primeros en llevar a cabo ensayos de transfección con dendrímeros. En ellos consiguieron transfectar ADNp que expresaba los genes de la luciferasa y β-galactosidasa, que son utilizados como genes reporteros, permitiendo cuantificar la eficacia de la transfección. Se probaron los dendrímeros de generaciones 1-10 en diversas líneas celulares, obteniéndose los

mejores porcentajes de transfección con la estructura de sexta generación, siempre que hubiera un exceso de grupos amino/nucleótido 6:1 en el complejo ADNp- dendrímero. Estos valores mejoraban sustancialmente los datos de transfección de otros polímeros catiónicos.23

En 1996 Roberts y colaboradores realizaron un estudio tanto in vitro como in

vivo en ratones que valoraba la toxicidad, inmunogenicidad y biodistribución de

dendrímeros PAMAM. En este estudio se reflejó que no causaban respuesta inmune en el organismo, y que las generaciones inferiores a la quinta sólo eran tóxicas en concentraciones muy elevadas, a diferencia de la séptima generación que causaba la muerte celular en todas las concentraciones ensayadas. La biodistribución en los órganos de los ratones resultó ser dependiente de la generación del dendrímero.38

Baker y colaboradores han demostrado en diversas publicaciones que los dendrímeros PAMAM son capaces de formar complejos con ADN en condiciones fisiológicas y que además pueden transfectar numerosas líneas celulares, aunque era necesario añadir pequeñas cantidades de DEAE-dextrano (dietilenaminoetil-dextrano), que son capaces de dispersar grandes agregados de ADNp-dendrímero en agregados de menor tamaño. Cuando estos agregados de mayor tamaño se forman, la eficiencia en la transfección se ve disminuida.41 Sin embargo, los resultados de los ensayos efectuados entraban en conflicto con la eficacia mostrada en los experimentos realizados por Szoka, que han sido mencionados previamente.

Una de las modificaciones más típicas realizadas en los dendrímeros PAMAM, para mejorar su capacidad de transfección, es formar conjugados con moléculas apolares. Szoka utilizó en sus ensayos originales de 1993 un péptido ambifílico que mejoraba la transfección.23 Juliano y colaboradores conjugaron una molécula fluorescente muy apolar para poder localizar el dendrímero en la célula, lo que les permitió observar que su comportamiento era diferente a los polímeros catiónicos, ya que el complejo ADNp-dendrímero persiste después de la entrada en la célula, mientras que con la unión ADNp-polímero se rompe tras escapar del endosoma.42 Además, la conjugación de esta molécula provocó un incremento en la capacidad de transfección del dendrímero PAMAM. Un ejemplo reciente de esta estrategia supuso la modificación de un dendrímero PAMAM de 2ª generación con cadenas alquílicas.

Esta modificación consiguió no sólo que fuera capaz de coordinar la cadena nucleica, sino que además mostró una gran capacidad de transfección.43 Otro estudio que utilizó esta aproximación conjugó aleatoriamente cadenas alquílicas de distinto tamaño a un dendrímero PAMAM de 5ª generación. Estos dendrímeros resultaron ser menos tóxicos cuanto mayor era el tamaño de la cadena alquílica conjugada.44

Otra modificación que se ha investigado es la variación de la flexibilidad del dendrímero PAMAM. Esta característica parece ser clave en el proceso de atravesar la membrana celular. El cambio más extendido hoy en día para mejorar la flexibilidad de los dendrímeros PAMAM es la degradación térmica del dendrímero. Este proceso provoca que haya una menor congestión en la superficie y hace que las ramas tengan mayor flexibilidad al haber aumentado su movilidad.45 Estas estructuras dendriméricas se comercializan bajo el nombre de Superfect.

El cambio del núcleo del dendrímero también puede colaborar, en cierta medida, a aumentar su flexibilidad. Zhang unió dendrones de hasta 8ª generación a núcleos que permitían enlazar 3, 4 y 6 de estas cuñas dendríticas. Esta modificación provee al dendrímero de huecos de tamaño variable cercanos al núcleo que permiten estudiar la movilidad de las ramas. La toxicidad de los dendrímeros con menor densidad de ramas resultó ser menor. Además, estos mismos dendrímeros resultaron ser los de mayor eficacia en la transfección.46 Una aproximación similar llevada a cabo por Park y colaboradores supuso la unión de dos cuñas PAMAM mediante una cadena de PEG. La naturaleza lineal de esta cadena central incrementa la flexibilidad del compuesto en comparación con un PAMAM comercial. Esta modificación provocó una disminución de la toxicidad, aunque la capacidad de transfección de estas macro moléculas no se vio incrementada.47

Dendrímeros polipropilenimina (PPI)

Al igual que los dendrímeros PAMAM, los PPI están disponibles comercialmente, lo que les ha conferido también una mayor difusión que otros tipos de estructuras dendríticas.

Los dendrímeros PPI de generaciones bajas, 2-5, han sido ensayados en la línea celular A431 de la epidermis, y han demostrado ser capaces de transfectar con eficiencia ADNp con los genes de la luciferasa y de la β-galactosidasa como genes reportadores.48 Esto contrasta con los dendrímeros PAMAM de baja generación. Sin embargo, los dendrímeros PPI de alta generación son muy tóxicos y poseen una capacidad de transfección muy baja, lo que impide su utilización en este campo.

Una de las modificaciones más exitosas realizadas en esta familia de dendrímeros es la formación de cargas positivas permanentes en la periferia, mediante cuaternización con MeI de dendrímeros de 2ª-4ª generación. Esta reacción provoca que la unión al ADN sea más fuerte y hace que la macromolécula formada sea coloidalmente más estable.49 Además, la biodistribución del complejo dendrímero- ADN se orienta hacia el hígado, a diferencia de otras nanosistemas catiónicos que se localizan en los pulmones.50-53

Al igual que en los dendrímeros PAMAM, se ha logrado conjugar moléculas de polietilenglicol a la superficie de los dendrímeros PPI buscando una disminución de la toxicidad causada por las cargas positivas de la estructura dendrítica. En 2006 Tack y colaboradores conjugaron la superficie de un dendrímero PPI de 5ª generación con cadenas de polietilenglicol y un péptido capaz de dirigir la transfección a células tumorales.54 Otro ejemplo de modificaciones sobre un dendrímero PPI, para disminuir la toxicidad, fue publicado en 2009. En este trabajo se formaron los complejos dendrímero-material nucleico y posteriormente estos complejos se estabilizaron formando enlaces disulfuro cruzados entre los grupos NH2 libres. Por último, se

conjugaron cadenas de PEG y un péptido capaz de dirigir la nanopartículas hacia los receptores de células tumorales. Estas modificaciones no sólo consiguieron proteger la cadena nucleica del las nucleasas sino que aumentó la absorción por parte de las células tumorales del ARNpi en comparación con la cadena nucleica aislada.55

En 2005 un dendrímero PPI de 3ª generación fue utilizado para transfectar ADNp al interior de células tumorales para tratar de promover la necrosis celular. El tratamiento de ratones con este nanoconjugado provocó la remisión del 100% de los tumores. Además, la inyección del dendrímero libre, sin el ADNp, mostró un

retardamiento en el crecimiento de los tumores, lo que permite concluir que el dendrímero tiene acción terapéutica per se.56

Dendrímeros poli(L-lisina) (PLL)

Con el desarrollo de la química de dendrímeros, se pensó en el uso de aminoácidos como unidad repetitiva, por ejemplo lisina.57 El uso de polímeros de lisina para la transfección tiene la desventaja de la gran toxicidad asociada a ellos, a pesar de que poseen una gran capacidad de transfección. Como regla general, al igual que en los dendrímeros PAMAM y a diferencia de los dendrímeros PPI, se considera que los dendrímeros más grandes en esta familia son los mejores agentes transfectantes.

Un ejemplo de la aplicación de estructuras dendriméricas tipo PLL supuso la utilización de dendrones de 5ª y 6ª generación como transfectantes de ADN.58 Estos fueron ensayados en una línea celular de riñón utilizando un exceso de carga 5:1. Los niveles de transfección resultantes fueron superiores a los transfectantes Superfect (PAMAM de alta generación degradado) y Lipofectina (un tipo de liposoma).

Sobre esta familia también se han realizado modificaciones para tratar de mejorar su capacidad de transfección. Una modificación realizada fue el uso de otros aminoácidos que no fueran lisina en la superficie del dendrímero. En concreto Niidome y colaboradores utilizaron residuos de arginina, resultando en un incremento de la capacidad de transfección de 3 a 12 veces, frente a dendrímeros compuestos enteramente por lisina, en células de ovario, riñón y células HeLa.59

Dendrímeros Polifosfohidrazona (PPH)

En los últimos años los dendrímeros PPH catiónicos sintetizados por Majoral y colaboradores han sido probados en numerosas aplicaciones, centrando su aplicación en el campo de los biomateriales,60 además de su uso como transfectantes de material genético al interior celular.

La toxicidad relativa a esta familia de dendrímeros ha sido medida en diversas líneas celulares tumorales y los resultados obtenidos reflejaron una toxicidad moderada, ligeramente inferior a la Lipofectina comercial.61

La primera prueba de transfección de este tipo de dendrímeros fue realizada en células 3T3, internalizado el gen de la luciferasa para cuantificar en qué medida era capaz de transportar material genético al núcleo. Se probaron dendrímeros de 4ª y 5ª generación en distintas concentraciones y en un exceso de carga 5:1 y 10:1 frente a los grupos fosfato de la cadena nucleica, resultando que aquellos cuaternizados con HCl, con iones cloruro como contraión, poseían una buena capacidad de transfección, comparable a polímeros lineales polietilenimina comerciales. Sin embargo, si el dendrímero estaba cuaternizado con MeI los valores de transfección eran muy inferiores. Esta discordancia se achacó a que en los segundos la densidad de carga es estable y puede alterar la membrana de las células transfectadas, produciéndose la lisis celular. Estos experimentos se complementaron con ensayos de transfección en líneas celulares de origen humano, internalizando un plásmido que expresaba la proteína EGFP, que es fluorescente.60

Dendrímeros Carbosilano (CBS)

En nuestro grupo de investigación se han desarrollado dendrímeros carbosilano catiónicos para aplicaciones biológicas. Como se ha señalado previamente en este capítulo, estudios con dendrímeros PAMAM han puesto de manifiesto resultados de transfección muy elevados en dendrímeros con alta flexibilidad, y con dominios apolares. Los dendrímeros carbosilano catiónicos poseen ambas características, ya que todos los enlaces de su estructura son C(sp3)-C(sp3) o C(sp3)-Si(sp3) y la polaridad del enlace C-Si es prácticamente nula.

En 2006 se publicó el primer ejemplo de una familia de dendrímeros carbosilano catiónicos, terminados en grupos trimetilamonio, para la transfección de material genético.62 Los dendrímeros aislados presentaban un buen perfil de toxicidad para las generaciones 1 y 2 hasta una concentración de 5 µM. También se realizaron ensayos de estabilidad del complejo ODN-dendrímero mediante electroforesis en gel de agarosa. Ambas generaciones del dendrímero resultaron ser capaces de unir al

ODN electrostáticamente, incluso en relaciones de carga muy bajas manteniéndose la estabilidad de los nanoconjugados hasta 24 horas, aunque se iba observando cierto grado de liberación progresiva del ODN debido a la hidrólisis de los enlaces Si-O que forman parte de la estructura.

En otro trabajo publicado en 2007 se mostraron nuevos dendrímeros carbosilano catiónicos tanto estables como inestables en disolución acuosa.63 Sobre los que se realizaron diversos ensayos de toxicidad en células mononucleares de sangre periférica, algunos de estos ensayos pusieron de manifiesto que estos dendrímeros eran menos tóxicos que un PAMAM de 4ª generación. Además, a pesar de su menor tamaño, eran capaces de retener un ODN hasta un pH inferior a 5.7. Los ensayos de microscopía confocal permitieron comprobar que estos dendrímeros eran capaces de internalizar ODN fluorescentes. Con estos dendrímeros también se han realizado experimentos que mostraban que el complejo dendrímero carbosilano-ODN es estable frente a la acción de la albúmina de suero bovino. Es este mismo trabajo se demostró, mediante un ensayo de competencia, que los dendrímeros carbosilano catiónicos eran capaces de romper las interacciones que se forman entre dicha proteína y los ODN.64

También se han realizado ensayos similares con estos dendrímeros carbosilano y ARNpi, probando la baja toxicidad de los sistemas dendrímero-ARNpi y su eficacia en la inhibición del VIH. Además de estas características, se ha demostrado la capacidad de estos sistemas en ensayos de transfección incluso en presencia de suero y antibióticos, lo que permite pensar en el uso de los dendrímeros carbosilano en experimentos in vivo.65

Ensayos similares se han llevado a cabo con otros tipos de dendrímeros carbosilano terminados en grupos trimetilamonio cuyo contraión es el anión triflato.66 En este estudio se utilizan estos dendrímeros junto a diversos ácidos nucleicos para el tratamiento in vitro de VIH y hepatocarcinoma. La caracterización quimico-física de los dendripejos muestra que los sistemas formados son estables en el tiempo y en un amplio rango de pH. Los ensayos biomédicos mostraron una actividad moderada en la transfección de ácidos nucleicos en la línea celular de hepatocarcinoma (HepG2), sin

embargo, los resultados obtenidos en la inhibición de VIH en CMSP mostraron un buen perfil de inhibición.

3.2 ANTECEDENTES DE DENDRÍMEROS CATIÓNICOS COMO