TIPOS DE MATERIAL GENÉTICO TRANSFECTADO Y MECANISMO DE ACCIÓN

Desde que se publicaron los primeros artículos en los años 70 sobre el uso de material genético con valor terapéutico, se han desarrollado distintas metodologías para la aplicación de los ácidos nucleicos en terapia contra diversas enfermedades, algunas de las cuales consisten en utilizar ADN plasmídico (ADNp), oligonucleótidos (ODN) y ARN pequeño de interferencia (ARNpi).

ADN plasmídico (ADNp)

Los plásmidos son moléculas de ADN circulares de origen bacteriano sobre las que se insertan genes. El ADNp es en sí mismo un transportador encargado de transfectar el material genético, que contiene el gen terapéutico y un gen promotor. Dentro del núcleo celular el ADNp, gracias al gen promotor que contiene, provoca la expresión del gen terapéutico, que puede ser “traducido” a un ARN mensajero (ARNm) que será el encargado de salir al citoplasma celular para expresar dicho gen en forma de una proteína funcional.

Este tipo de terapia fue uno de los primeros métodos utilizados en terapia génica bajo el nombre de “ADN desnudo”. Sin embargo, aunque es un método válido para ciertas líneas celulares, generalmente es muy poco eficaz para transfectar material genético al interior de una célula. Tan solo una pequeña parte del ADNp es capaz de alcanzar el núcleo celular,4-6 debido al gran tamaño del ADNp y su rápida degradación causada por la presencia de nucleasas.5-11

La utilización de ADNp generalmente se lleva a cabo utilizando algún tipo de ayuda externa o de otro vector que lo proteja y transporte al interior celular. Este tipo de ayudas pueden ser físicas (biobalística,12,13 electroporación,14,15 inyección directa,16 etc.), aunque este tipo de medidas suelen poner en riesgo la integridad de la membrana celular. Otra metodología consiste en la utilización de un compuesto químico sintético que se una al ADNp condensándolo a su alrededor.

Oligonucleótidos

Los ODN son un tipo de secuencia de ácidos nucleicos, ya sea ADN o ARN, de pequeño tamaño, generalmente inferior a 50 pares de bases. Se suelen considerar tres mecanismos de acción para los ODN en la regulación de la expresión génica: silenciamiento de ARN mensajero (ARNm), la formación de ADN triplex, o unirse a un factor de transcripción.

1. El silenciamiento de ARNm se produce una vez se ha transcrito un gen a su forma de ARNm. La presencia de un ODN en el núcleo que posea una secuencia complementaria de un fragmento de ese ARNm, hace que ambos se unan siguiendo el modelo descubierto por Watson y Crick. La doble hélice formada impide que el ARNm se una a los ribosomas encargados de la formación de la proteína correspondiente al gen transcrito. Este tipo de terapia se la denomina terapia antisentido.

2. La formación de ADN triplex supone la unión del ODN a una parte de una molécula de ADN que contiene un gen diana. Esta asociación de tres cadenas es capaz de inhibir la transcripción del gen a ARNm anulando su expresión. Este tipo de terapia posee la ventaja, frente al silenciamiento del ARNm, que necesita de menores cantidades de ODN para ser efectivo ya que una sola molécula de ODN es capaz de bloquear cualquier formación de ARNm.

3. Los factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias concretas de ADN y que regulan la transcripción de la cadena de ADN a ARNm. La unión de un ODN a los factores de transcripción hace que

éste último sea incapaz de unirse al ADN y, por tanto, que comience la formación por los ribosomas de la cadena de ARNm asociada a ese gen.

Generalmente, el uso de ODN requiere la utilización de agentes transfectantes para que ejerzan su función, ya que poseen un corto tiempo de vida in vivo y no son capaces de atravesar la membrana celular, debido a la alta carga negativa que poseen.17,18 Los ODN también se benefician de los métodos físicos utilizados para la transfección de ADNp, mencionados previamente en este capítulo. Todos estos inconvenientes, hacen que aunque la terapia con ODN sea efectiva in vitro, tenga aplicaciones limitadas in vivo.19

ARN pequeño de interferencia (ARNpi)

El ARNpi es un tipo de ARN de doble cadena que puede regular la expresión selectiva de genes específicos. Este método está englobado en la terapia antisentido.

El mecanismo de silenciamiento mediante ARNpi comienza con la acción del complejo de silenciamiento inducido por ARN (en sus siglas en inglés RISC), que es un complejo que incorpora la hebra antisentido del ARNpi y la utiliza para encontrar el ARNm complementario bloqueándolo y eliminándolo mediante la acción de una ribonucleasa incluida en el complejo.20 Este tipo de mecanismo, debido a que activa la acción catalítica de una proteína que degrada el material genético, es capaz de actuar a concentraciones muy por debajo de las necesarias para aplicar la terapia antisentido con ODN, siendo este mecanismo 1000 veces más efectivo que la terapia con ODN.21

Al igual que en otros ácidos nucleicos el ARNpi se degrada rápidamente en el organismo por la acción de las nucleasas. Aunque su tiempo de vida media es superior al de los ODN, es necesario realizar modificaciones químicas sobre éste,22 o unirlo a vectores que lo protejan y lo ayuden a atravesar membranas biológicas. Otra ventaja de este tipo de terapia con ácidos nucleicos es que la acción del ARNpi ocurre en el citosol por lo que no es necesario atravesar la membrana nuclear.