Determinación de la cinética de lacasas de las cepas seleccionadas

La actividad enzimática se evaluó con 4 substratos: DMP (2, 6-dimetoxifenol), Siringaldazina (SYR, Sigma, E.U.A.), ABTS [2, 2‟-Azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] (Sigma, E.U.A.) y Guaiacol (GY, Sigma, E.U.A.). Con ellos se pudo observar la afinidad de las lacasas de Pleurotus por determinado substrato, de la misma manera que en el

corrimiento enzimático en los geles de poliacrilamida (PAGE).

De los cuatro substratos que se utilizaron para evaluar la actividad enzimática, la mayor respuesta se presentó con DMP en las tres cepas que se estudiaron, sin embargo, la producción de las enzimas es muy diferente entre las tres especies. Esto fue similar a las observaciones realizadas por Cho et al. (2002), quienes determinaron las actividades de lacasas y peroxidasas

durante las etapas de desarrollo de primordio y fructificación de P. ostreatus y P. sajor-caju. En

el caso de P. ostreatus, el nivel de la peroxidasa dependiente de Mn se encontró baja en la etapa

de primordio y gradualmente se incrementó con el desarrollo del cuerpo fructífero, mientras que en P. sajor-caju, no se detectó actividad en ninguna de las etapas. Así, en el presente trabajo se

demostraron diferencias significativas en la producción de lacasa a nivel micelial en P. ostreatus

(CP-50), P. djamor (CP-253), y P. sp. ( “Hongos del Maguey”). En el substrato DMP, la cepa

CP-50 presentó su mayor actividad a las 48 h con un valor de 292.55 U/ml, mientras que la cepa CP-253 obtuvo un valor máximo de 39.96 U/ml a las 120 h, y la cepa CP-460 presentó su actividad máxima a las 96 h, con una actividad de 142.86 U/ml (Tabla 6.16).

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Tabla 6.16. Actividad volumétrica (AV) de lacasas de las cepas de referencia de Pleurotus ostreatus (CP-50) y P. djamor (CP-253), en comparación con una cepa seleccionada de

los “Hongos del Maguey” (Pleurotus sp.; CP-460).

Tiempo (h)

Actividad volumétrica (U/ml)

CP-50 CP-253 CP-460 0 3.49 0.00 7.66 24 24.95 1.04 2.99 44 268.16 10.62 20.78 48 292.54 11.6 15.32 72 243.82 25.46 49.35 96 119.46 36.96 142.86 120 64.94 39.96 115.06 144 39.50 10.22 92.04

Por otra parte, al realizar el corrimiento electroforético, en el caso de la cepa CP-50, en el carril que corresponde a las 72 h se comenzaron a observar dos bandas, lo cual indicó que se están produciendo dos isoenzimas. La primera y más definida se ubicó en la parte baja del gel y fue de bajo peso molecular. En cambio, la CP-253 mostró sólo una banda difusa en la parte superior del gel, la cual fue de alto peso molecular y gradualmente se definió entre las 72 y 120 h (Figura 6.9).

Al evaluar la producción enzimática con SYR, la CP-50 obtuvo su máximo a las 48 h, con un valor de 78.74 U/ml, mientras que la CP-253 logró su valor máximo a las 120 h con 18.29 U/ml (Figura 6.10). Estos resultados se vieron reflejados en el gel de poliacrilamida, donde se apreciaron bandas más tenues que las observadas con DMP. Es decir, las enzimas producidas no presentaron gran afinidad por la SYR, en comparación con el DMP.

En cuanto al comportamiento de la cinética que presentan las enzimas producidas, se observó en todos los casos un pico de producción, el cual decreció posteriormente. Esto puede deberse a que los nutrientes se agotaron, o bien, a que la concentración de metabolitos producidos por el micelio inhibieron la producción enzimática. En cuanto a la variación

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interespecífica en los niveles enzimáticos, es claro que la cepa CP-253 mostró niveles inferiores de lacasas, probablemente porque se trata de una cepa silvestre, sin mejoramiento genético, y por ser una característica de la especie.

Figura 6.9. Evaluación de la actividad volumétrica (AV) de lacasas utilizando DMP: a: Cinética de las cepas CP-50, CP-253 y CP-460 de Pleurotus. b: Corrimiento electroforético

(PAGE). b

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Figura 6.10. Evaluación de la actividad volumétrica de lacasas utilizando Siringaldazina (SYR). a: Cinética de las cepas CP-50 y CP-253 de Pleurotus. b: Corrimiento electroforético

(PAGE).

La actividad enzimática de las lacasas con el substrato ABTS fue más baja en comparación con DMP y SYR, donde la producción máxima de enzima para la CP-50 se presentó a las 48 h y 72 h, con una actividad enzimática sobre el substrato ABTS de 43.67 y 44.66 U/ml, respectivamente. En la CP-253, el valor máximo se determinó a las 120 h, con 21.66 U/ml. En el

a

b

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gel, se observó una doble banda a las 48 h en el caso de la cepa CP-50, esto representó la presencia de dos isoenzimas. Conforme transcurre el tiempo, la isoenzima de menor peso molecular disminuyó, en tanto que la isoenzima de mayor peso molecular se definió mejor conforme transcurrió el tiempo (Figura 6.11).

Figura 6.11. Evaluación de la actividad volumétrica de lacasas utilizando ABTS. a: Cinética de las cepas CP-50 y CP-253 de Pleurotus. b: Corrimiento electroforético (PAGE).

Finalmente, al evaluar con el substrato de GY, la afinidad enzimática por este substrato resultó ser muy baja para la cepa CP-50, con un máximo a las 48 h de 38.79 U/ml. Esto

a

b

CP253

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correspondió en el corrimiento electroforético a una banda un poco más marcada que el resto y, es importante hacer notar, que en este caso, sólo se pudo observar una sola banda producida. En las determinaciones con los otros substratos, se presentaron dos bandas, correspondientes a dos isoenzimas con diferente afinidad al substrato. Sin embargo, en la cepa CP-253, cuyos valores enzimáticos fueron muy bajos y que alcanzó un pico a las 120 h, con una actividad enzimática de 5.61 U/ml, no fue posible revelarla en el gel de poliacrilamida (Figura 6.12). A futuro, valdría la pena repetir el experimento incrementando las concentraciones enzimáticas.

Figura 6.12. Evaluación de la actividad volumétrica de lacasas utilizando guaiacol: a: Cinética de las cepas CP-50 y CP-253 de Pleurotus; b: Corrimiento electroforético (PAGE).

Actividad volumétrica con GY

a

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