Determinación de posiciones relativas: Relación de frente (Rf) Es el cociente entre la distancia recorrida por el compuesto (mancha)

y la distancia recorrida por el solvente de desarrollo:

Rf(A) = Distancia recorrida por la sustancia A Distancia recorrida por el disolvente

Nueva posición del compuesto A Frente del disolvente Origen 2.9 cm 2.0 cm Rf(A) = 2.0 2.9 = 0.68

La Rf es constante para cada compuesto, siempre que se respeten una serie de variables como:

a) sistema de disolvente de corrida, b) adsorbente, c) espesor de la capa de adsorbente, d) cantidad de material sembrado, e) temperatura ambiente.

El valor de Rf puede ser utilizado para identificación, pero no como criterio único ya que varios compuestos pueden tener la misma Rf con determinada mezcla de disolventes.

Muestra sembrada 1 cm Capilar Nivel del disolvente Cámara cromatográfica

a.2. - Cromatografía en papel

Esta técnica utiliza como soporte una tira de papel cromatográfico. Para separaciones de tipo analíticas se emplea papel Whatman Nº 1 y 3 y para cromatografías preparativas, papel Whatman Nº 3 ó 3 MM. El papel cromatográfico colocado en una atmósfera saturada con vapores de agua puede absorber entre un 20 - 25% de agua. El agua retenida por el papel es la fase estacionaria, que tiene un poder disolvente distinto al agua pura, frente a los solutos. Debido a este hecho, es posible una partición entre el agua de la fase estacionaria y otro disolvente inmiscible o no que, inclusive, puede ser agua pura.

La Rf de los distintos componentes de la muestra depende del coeficiente de partición y de las cantidades relativas de las dos fases en contacto.

El disolvente de desarrollo y la naturaleza de los grupos funcionales presentes en los solutos, son las variables más importantes que determinan las movilidades relativas entre ellos.

Como la fase móvil es un disolvente orgánico saturado en agua, la polaridad de dicha fase será siempre menor que la de la fase estacionaria, por lo que las sustancias más polares serán retenidas con mayor fuerza, y las sustancias menos polares se desplazarán más rápidamente de la zona de siembra.

Los pasos a seguir en una cromatografía en papel son:

1 Siembra: La muestra a separar se coloca en uno de los extremos del papel, con ayuda de una micropipeta.

2 Colocación en la cámara cromatográfica: Se deberán tener en cuenta las precauciones mencionadas para la CCD: saturar la cámara antes de colocar el papel, los disolventes de corrida deben estar anhidros y si son mezclas de disolventes deben ser miscibles entre sí.

3 Desarrollo: El desarrollo puede ser de tipo ascendente o descendente. En la figura 2 se muestra una cromatografía en papel de tipo ascendente. El extremo del papel donde se sembró la muestra es expuesto al disolvente o mezcla de disolventes apropiados. Estos penetran, solubilizan y arrastran la muestra, separando según la afinidad entre los disolventes y la muestra. Los componentes más solubles en la fase móvil migran a mayor velocidad que los menos solubles, que quedarán retardados en la fase estacionaria.

4 Revelado y determinación de posiciones relativas (Rfs): Luego de la separación, los componentes de la mezcla se distinguirán por las

posiciones relativas que ocupan sobre el papel, poniéndolas en evidencia mediante reacciones de detección.

Figura 2:

Cromatografía en papel ascendente

Tal vez el mayor interés que despierta este tipo de cromatografía no sea la simplicidad de su material, sino que puede ser utilizada a escala analítica. Así, existe la posibilidad de analizar cantidades de hasta 1 mg e incluso, con marcadores enzimáticos o radiactivos, la sensibilidad llega a ser hasta mil veces mayor.

En casos donde se requiere una separación más fina o cuando las sustancias a separar sean muy semejantes, puede recurrirse a la cromatografía bidimensional que es una variante de la anterior (Fig. 3). Se desarrolla la cromatografía en un sentido, se da un giro de 90º a la hoja soporte y se realiza un segundo desarrollo con otro disolvente. El resultado permite observar cómo los compuestos homólogos se ubican en una curva que puede ser más o menos regular según varíe su coeficiente de partición. La cromatografía bidireccional también puede aplicarse a la técnica de capa delgada.

Figura 3: Cromatografía en papel bidimensional

Disolvente Tapa

Papel Frente del disolvente

b) Cromatografía en columna

Se emplea para la separación de mezclas y purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria (adsorbente) se usa, generalmente, sílice o alúmina contenida en una columna (Fig. 4). El disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien con aplicación de presión (se habla de percolación). El tamaño de la columna está determinado por la cantidad de mezcla a separar. La relación de masa de muestra a masa de adsorbente es de 1:100 a 1:500. La velocidad a la cual el disolvente fluye a través de la columna se denomina velocidad de elusión y es importante en la efectividad de la separación.

En general, el tiempo que la mezcla a separar permanece en la columna es directamente proporcional a la magnitud del equilibrio entre las fases estacionaria y móvil. Por lo tanto, compuestos similares pueden eventualmente separarse si permanecen en la columna el tiempo suficiente. El tiempo que una sustancia permanece en la columna, depende de la velocidad de flujo del disolvente y ésta es afectada, en gran medida, por el “ empaquetamiento” de la fase estacionaria dentro de la columna y, en menor medida, por la presión y la temperatura del sistema. Si el flujo es muy lento, las sustancias de la mezcla, cuando están en el disolvente, pueden difundir más rápidamente que la velocidad a la cual se mueven hacia abajo en la columna. En este caso las bandas se ensanchan, se hacen difusas, resultando en una separación pobre.

Las ventajas que presenta este método cromatográfico sobre la cromatografía en placa delgada son:

1- Permite sembrar y separa mayor cantidad de muestra.

2- Se pueden realizar cambios secuenciales de la polaridad del disolvente de elusión (serie eluotrópica), lo que mejora la eficiencia de la separación. 3- Hay un desplazamiento ilimitado del frente del disolvente.

Pasos a seguir en una cromatografía en columna

1 Preparación de la columna: Se mezcla el adsorbente con el disolvente y se vierten en el interior de la columna. Previamente se coloca en el extremo inferior de la misma un trozo de algodón o lana de vidrio, para evitar que el adsorbente se escape por el extremo de la columna. Existe una gran variedad de adsorbentes para CCD: sílica gel, óxido de aluminio, carbón activado, silicato de magnesio, celita, celulosa, almidón, etc., siendo los dos primeros los más utilizados.

2 Siembra: La muestra, disuelta en el disolvente, se introduce por la parte superior de la columna y se deposita sobre la superficie del adsorbente. Deberá presentar un aspecto de disco de espesor delgado y uniforme. La elección de un disolvente está gobernada

por su polaridad y por la naturaleza del adsorbente. Los disolventes más utilizados son: éter de petróleo, n-hexano, ciclohexano, cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, benceno, éter etílico, acetato de etilo, acetona, etanol, metanol, agua, ácido acético, etc.; ya sea solos o en mezclas binarias o complejas.

3 Desarrollo cromatográfico (elusión de la columna): El adsorbente es lavado continuamente con el flujo de disolvente, el cual es ingresado por el extremo superior de la columna.

Inicialmente, los componentes de la mezcla se adsorben en las partículas del adsorbente ubicadas en la parte superior de la columna. El flujo continuo de disolvente a través de la columna eluye o lava los solutos del adsorbente y los lleva hacia abajo. Los solutos (o materiales que se separan) se llaman eluatos y el disolvente eluyente.

Frecuentemente, se comienza la elusión con un disolvente no polar para remover compuestos relativamente poco polares y luego, gradualmente, se aumenta la polaridad del disolvente para forzar a los compuestos de mayor polaridad a descender por la columna o fluir, es decir, se realiza un gradiente de fase móvil. Cuando la polaridad del disolvente deber ser cambiada durante una separación cromatográfica, deben evitarse cambios bruscos de un disolvente a otro. El cambio de polaridad de los disolventes debe ser gradual.

A medida que los solutos se mueven hacia abajo en la columna a zonas de adsorbente fresco, nuevos equilibrios se establecen entre el adsorbente, los solutos y el disolvente. Los diferentes componentes de la mezcla migran a diferentes velocidades dependiendo de su afinidad relativa por el adsorbente y por el disolvente.

Debido a que el número de partículas del adsorbente es grande, están estrechamente empaquetadas y continuamente se agrega solvente fresco, el número de equilibrios entre el adsorbente y el disolvente que experimenta el soluto es enorme.

A medida que los componentes de la mezcla se separan, comienzan a formar bandas. Si la columna es lo suficientemente larga y los parámetros (diámetro de la columna, adsorbente, disolvente y velocidad de flujo) se eligen correctamente, es posible separar secuencialmente cada componente de la mezcla en estado puro y espaciado del siguiente componente por una alícuota de solvente puro.

Cuando los componentes son coloreados es sencillo determinar el momento para recoger cada fracción. Si no lo son, es necesario realizar un seguimiento del eluato por cromatografía en capa delgada.

Si los parámetros anteriormente citados se eligen en forma incorrecta, las distintas bandas se superponen o coinciden y el resultado es una separación pobre o nula.

4 Revelado: Consiste en analizar el eluato por cromatografía en capa delgada con reveladores adecuados.

Figura 4: Cromatografía en columna Mezcla Adsorbente Algodón Disolvente Más polar Menos polar b.1. - Cromatografía gaseosa

En la cromatografía de gases, la fase móvil es un gas que transporta al soluto, el cual, a la temperatura de trabajo, también se encuentra en estado gaseoso.

b.1.1.- Cromatografía de adsorción gas-sólido: utiliza como fase estacionaria partículas sólidas sobre las que el soluto puede adsorberse. Tiene un rango limitado de aplicación (se usa especialmente para separar gases)

b.1.2.- Cromatografía de partición gas-líquida: Es una técnica muy utilizada; emplea como fase estacionaria un líquido no volátil, adsorbido en la superficie de un soporte sólido inerte (columnas rellenas o empaquetadas) o en la pared interna de un tubo capilar (columnas capilares).

La base de la separación radica en la partición de la muestra entre el gas portador y la fase líquida. Existe una gran variedad de fases líquidas, muchas de las cuales pueden utilizarse a temperaturas superiores a los 400 ºC.

El equipo que lleva a cabo la separación es el cromatógrafo de gases. Un esquema del mismo se muestra en la figura 5:

Figura 5: Diagrama de un cromatógrafo de gases

1

2

3

4 5

6

1- Tubo de gas portador 2- Inyector

3- Columna 4- Detector 5- Registrador 6- Cromatograma

1- Tubo de gas portador: El gas comprimido en el tubo puede ser He2, N2, H2, Ar o CO2. El gas portador transporta o arrastra los componentes de la muestra a través de la columna. El gas portador debe ser inerte (tanto con la muestra como con la fase estacionaria), fácilmente disponible y con alto grado de pureza.

2- Inyector: Dispositivo que permite introducir la muestra en la corriente del gas portador. La muestra se inyecta en estado líquido. La condición esencial para poder analizar una mezcla por CG es que sus componentes sean “ vaporizables” . Si las sustancias tienen presiones de vapor despreciables, se fijarán a la fase estacionaria y no podrán ser eluídas por el gas portador. En estos casos se puede derivatizar la muestra, esto es, convertir grupos funcionales polares en sus derivados de menor polaridad (Ej. esterificación de alcoholes, fenoles o ácidos carboxílicos, etc.), lo que contribuye a aumentar la presión de vapor del soluto.

3- Columna: Las columnas son tubos de vidrio o metal (cobre, aluminio, acero inoxidable), de longitud variable (1 a 60 m). El diámetro interno

puede variar desde 0.20 a 10 mm dependiendo del tipo de columna (rellena o capilar). Las columna rellenas contienen un adsorbente “empaquetado” . En algunos casos la carga puede ser un sólido inerte recubierto con una película líquida en donde ocurre la partición. Las columnas capilares generalmente se presentan enrolladas en forma de espiral lo que permite obtener longitudes de hasta 60 m, con un diámetro interno de 0.20 – 0.50 mm. Las paredes internas están recubiertas por una delgada capa líquida, no volátil (la fase estacionaria), en donde se produce la partición.

La velocidad con la que se mueven las sustancias dentro de la columna depende de la temperatura de análisis, la velocidad de flujo del gas portador y la medida en que el vapor de la sustancia es retenido. El tiempo que transcurre entre el momento en que los componentes de la muestra entran a la columna y son detectados se denomina tiempo de retención. Aquellos compuestos más afines a la fase estacionaria serán eluíos tardíamente en relación a los más afines a la fase móvil.

Factores que afectan la efectividad de una separación: - Longitud de la columna

- Diámetro de la columna

- Tamaño de las partículas del relleno (columnas empaquetadas) - Naturaleza de las fases

- Cantidad de fase estacionaria - Temperatura de la columna

- Velocidad de flujo del gas portador - Cantidad de muestra inyectada

4- Detector: Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica.

El detector es capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una señal cuantificable y ofrecer información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. El detector funciona comparando una propiedad física (por ej. la conductividad eléctrica) entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna. Esta acción se traduce en una señal eléctrica, que posteriormente es amplificada mediante un registrador gráfico o integrador permitiendo indicar el tiempo y la magnitud (concentración) de los componentes.

Los detectores más utilizados en cromatografía de gases son: - Detector de conductividad térmica: mide la conductividad térmica del gas portador, ocasionada por la presencia de las sustancias eluidas.

- Detector de ionización de llama: su funcionamiento se basa en la medida de la variación de la corriente de ionización en una llama de oxígeno- hidrógeno debido a la presencia de las sustancias eluídas.

- Detector de captura electrónica: su funcionamiento se basa en la electronegatividad de las sustancias eluidas y su habilidad para formar iones negativos por captura electrónica.

5- Registrador: la señal emitida por el detector es recogida por el registrador.

6- Cromatograma: es un registro en forma de picos, cada uno de los cuales representa una sustancia pura.

La cromatografía gas-líquida presenta las siguientes ventajas:

1) La columna es continuamente regenerada (sale todo lo que entra). 2) Los tiempos de análisis son normalmente cortos (algunos pocos

minutos).

3) Se requieren pequeñas cantidades de muestra (1-5 _µl).

4) Resolución: se ha logrado resolver mezclas de sustancias que sólo difieren en el grado de insaturación.

5) Análisis cualitativo: el tiempo de retención es característico de cada sustancia en una determinada fase líquida, a una determinada temperatura y velocidad de flujo del gas portador, y no es influenciado por la presencia de otras sustancias. Con adecuados controles de flujo del gas portador y de la temperatura de la columna se han logrado reproducibilidades de tiempos de retención dentro del 1 %.

6) Análisis cuantitativo: el área de cada pico es proporcional a la concentración de la sustancia y puede transformarse en la verdadera concentración aplicando los factores de corrección correspondientes.

7) Sensibilidad: es uno de los principales factores que han impulsado el uso intensivo de esta técnica de análisis. Los detectores de conductividad térmica, que son los menos sensibles, pueden detectar cantidades inferiores al 0.01% (100 ppm). El detector de ionización de llama aprecia fácilmente 1 ppm y los detectores de fósforo pueden medir partes por billón.

En términos generales el proceso de análisis de una muestra por cromatografía gaseosa se puede resumir de la siguiente manera:

Se introduce la muestra en la cámara de inyección (previamente calentada). Las muestras se volatilizan sin que sufran descomposición y son arrastradas por el gas portador a la columna en donde se producen infinitas particiones entre el gas y la fase estacionaria líquida. A medida que cada componente sale de la columna, su presencia es detectada por un censor eléctrico (detector), el que genera una señal recogida por un registrador, resultando así un cromatograma, que presenta tantos picos como sustancias diferentes tenga la muestra.

b.2. Cromatografía líquida

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido. Como ocurre en cromatografía gaseosa, la fase estacionaria puede ser un sólido (cromatografía de adsorción líquido-sólido) o un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido).

b.2.1. Cromatografía líquido-sólido:

Dentro de la cromatografía líquido–sólido, está incluida la cromatografía en columna clásica, descripta en el apartado b) del presente capítulo. Este método cromatográfico de adsorción se basa en la competencia que existe entre las moléculas de la muestra y las de la fase móvil por ocupar los sitios activos en la superficie de un sólido (fase estacionaria).

En muchas ocasiones, debido a una fuerte adsorción de los componentes de la muestra en el sólido activo, es necesario aumentar la polaridad de la fase móvil en forma constante y uniforme, con lo cual se logra un incremento de solubilidad de los compuestos en la fase móvil. A esta variante se la denomina elusión por gradiente o programación de la fase móvil.

b.2.2. Cromatografía líquida-líquida

El mecanismo de separación en esta técnica, se basa en las diferencias de solubilidad que poseen los componentes de la muestra en las dos fases líquidas (móvil y estacionaria). De ahí que los compuestos más solubles en la fase estacionaria sean retenidos selectivamente por ella, mientras que los de menor solubilidad sean transportados más rápidamente por la fase móvil.

Este tipo de cromatografía se utiliza para compuestos moderadamente polares y requiere un control cuidadoso del flujo y de la temperatura para poder identificar un compuesto determinado en función del tiempo de elusión, que es característico de cada compuesto en las condiciones de trabajo elegidas.

b.2.2.1. Cromatografía líquida de alta presión (C.L.A.P.), (en inglés HPLC)

En este método se utilizan columnas de diámetro reducido, rellenas con materiales finamente pulverizados (5 -10 _{µ de diámetro) y muy} empaquetadas, por lo que se requiere presión para que el disolvente fluya a una velocidad razonable (1 ml/min) (Fig. 6). La separación puede ocurrir por adsorción o partición.

Detector Columna Inyector Bomba de alta presión Sistema de adquisición y procesamiento de datos Solvente

Figura 6: Esquema de un cromatógrafo líquido de alta presión (CLAP) Para el análisis de muestras por CLAP se requiere que las mismas sean algo soluble en la fase móvil. Este hecho permite el análisis de compuestos de alto peso molecular, tanto orgánicos como inorgánicos, iónicos o covalentes.

En términos generales, para el análisis de muestras por CLAP se opera de la siguiente manera: desde el reservorio del disolvente, la bomba entrega un flujo continuo. La fase móvil fluye a través de la cámara de inyección hacia la columna. A partir de la salida de la bomba el sistema tiene alta presión. La presión interna de la columna se mide con un manómetro. Al salir cada componente de la muestra se hacen sensibles al detector, el cual esta conectado a un registrador.

b.2.3. – Cromatografía de intercambio iónico

Este tipo de técnica cromatográfica, se aplica para la separación de sustancias iónicas (orgánicas e inorgánicas) de un amplio intervalo de pesos moleculares. Ejemplos característicos de éstos son péptidos, aminoácidos, alcaloides, etc.

Las separaciones de intercambio iónico se llevan a cabo con materiales especiales de estructuras porosas e insolubles. Estos materiales contienen grupos reactivos que están asociados a iones lábiles capaces de intercambiarse con los del medio que los rodea. El intercambio de iones es el único fenómeno que ocurre en el material durante todo el