DETERMINACIONES INMUNOLÓGICAS

3.1.1. Subpoblaciones linfocitarias en sangre

Una vez sacrificados los animales, se obtuvieron muestras de sangre periférica en un

eppendorf heparinizado para analizar subpoblaciones linfocitarias. El método empleado se

basa en la unión de distintos anticuerpos específicos con su correspondiente determinante antigénico expresado en la superficie de los linfocitos. Estos anticuerpos llevan unida una molécula fluorescente, cuya emisión permite su detección, diferenciando así las células que tienen unido el anticuerpo (positivas) de las que no (negativas) (Díaz 2006).

La sangre se mantuvo a temperatura ambiente por un tiempo no superior a los 30 min. Las subpoblaciones linfocitarias se determinaron mediante la incubación de la sangre 30 min en oscuridad con los anticuerpos monoclonales correspondientes a cada subpoblación de interés, usando controles para cada tipo de fluorescencia: linfocitos T maduros (CD3+), linfocitos T colaboradores (CD4+), linfocitos T citotóxicos (CD8+), células NK (CD335+), y linfocitos B (CD19+, CD5+). Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo (FACSCalibur Flow Cytometer, Becton Dickinson), obteniéndose los porcentajes de los distintos tipos de linfocitos: FACSCalibur de BECTON DICKINSON puede medir simultáneamente

forward scatter, side scatter y 4 fluorescencias usando dos láseres (un láser de argón de 15

mw, refrigerado por aire, operando a 488 nm y un láser diodo a 635 nm). El análisis de resultados se realizó con ayuda del software CellQuestPro (BD Biosciences).

3.1.2. Subpoblaciones linfocitarias en bazo

Los bazos fueron disgregados usando el sistema Medimachine, para obtener leucocitos mononucleares. Los extractos de bazo se lavaron añadiendo suero salino hasta 14mL y se centrifugó 7 min a 1000 rpm. El precipitado obtenido se resuspendió y se ajustó a un volumen

de 2 mL. A este volumen se le agregaron 5mL de una solución de cloruro amónico (NH4Cl) al

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Después se volvió a centrifugar y se le añadió suero salino hasta un volumen final de 15 mL, y se centrifugó una vez más a 1000 rpm durante 7 min. Después se eliminó el sobrenadante, y tras resuspender el precipitado se le añadió suero salino hasta un volumen de 5mL.

Al finalizar el procedimiento de purificación de los linfocitos de bazo se estableció su número por mL, realizando un recuento en una cámara de Neubauer (BLAU BRAND). Se hizo una última centrifugación como las anteriores y se ajustó el volumen a 1x106 células por mL.

Después se marcaron las células con los anticuerpos monoclonales, siguiendo protocolo descrito en el apartado anterior. Al igual que con la sangre, las suspensiones celulares de bazo fueron analizadas mediante citometría de flujo (FACSCalibur, BECTON DICKINSON).

3.2. Análisis de producción de citoquinas por linfocitos de sangre periférica

La determinación de la producción de citoquinas fue realizada en alícuotas de sangre de 300 μl. Para la estimulación de los linfocitos se utilizó el mitógeno LPS a 1,5 µg/mL de concentración, y posteriormente se valoraron los niveles de citoquinas en el sobrenadante mediante citometría de flujo (Luminex 100 TM v 2.3), con anticuerpos específicos para IL-6, IL- 1β y TNF-α (Multiplex, Millipore), tal y como se ha descrito en la sección 2.4 de este capítulo.

3.3. Determinaciones en tejido adiposo 3.3.1. Aislamiento de los adipocitos

Inmediatamente tras el sacrificio de los animales, se procedió a la extirpación del tejido graso. El aislamiento de los adipocitos se realizó en condiciones de esterilidad bajo campana de seguridad biológica de flujo laminar. El tejido adiposo extraído se colocó sobre una placa de Petri en tampón HEPES-fosfato atemperado a 37ºC. El aislamiento de los adipocitos a partir del tejido se realizó según el protocolo de Rodbell (1964) con ligeras modificaciones (Lorente- Cebrián y col., 2006). De esta forma, una vez pesado el tejido, se troceó con tijeras durante 90 segundos. Seguidamente, se incubó este tejido parcialmente digerido con una solución de colagenasa tipo I (Worthington Biochemical Corporation Vassar Ave., Lakewood): 1,25 mg/mL por 0,5 g de tejido durante 30 min a 37ºC y con agitación constante.

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Transcurrido este tiempo, se neutralizó la acción de la colagenasa mediante la adición de tampón HEPES-fosfato (24 mL) e inmediatamente se procedió a la filtración del tejido. Para esto último, se utilizaron membranas de nylon de 400 µm de tamaño de poro previamente esterilizadas, para retener el tejido no digerido y obtener los adipocitos aislados.

A continuación, se realizaron dos lavados con HEPES-fosfato con el fin de eliminar restos de colagenasa, y se centrifugó la suspensión durante 6 min a 500 x g. Tras la centrifugación, se obtenía en la parte superior la suspensión celular de adipocitos y en la fase inferior, los restos de y otros tipos celulares como pre-adipocitos y células sanguíneas.

Esta fase inferior se eliminó utilizando cánulas metálicas revestidas de un aislamiento de goma (para evitar la lisis de los adipocitos en contacto con el metal) y acopladas a jeringas. Después, se realizó un último lavado utilizando medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco®) suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB) al 1% [SFBHeat Inactivated, Biowhittaker (DE14-801FH)] y se procedió de nuevo a centrifugación en las mismas condiciones. Tras retirar de nuevo el infra nadante, se volvió a añadir DMEM hasta 12-14 mL y los adipocitos aislados se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 durante 30-40 min en incubador

termostatizado con atmósfera de CO2 regulable (KOWELL y HERAEUS).

3.3.2. Cultivo de adipocitos

Transcurridos los 30-40 min de incubación, se retiró la fase inferior hasta obtener una relación volumétrica 2:1 de células/medio, que se mezclaron hasta obtener una suspensión celular homogénea. Seguidamente, los adipocitos se cultivaron en placas de 6 pocillos en una matriz de colágeno.

Para ello, se añadieron 500 µl de la solución de colágeno preparada con anterioridad sobre cada pocillo y sobre esta, 150 µl de la suspensión celular de adipocitos. La matriz de colágeno con los adipocitos se extendió cuidadosamente sobre la superficie del pocillo girando y agitando cuidadosamente hasta obtener una distribución homogénea de las células sobre la capa de colágeno.

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A continuación, las placas se incubaron durante 40-50 min (37ºC y 5% CO2) para que se produjera la solidificación de la capa de colágeno, en la que quedaban atrapados los adipocitos, favoreciendo así unas condiciones de cultivo más parecidas a la situación fisiológica de los adipocitos en el tejido adiposo, en comparación a ser estos cultivados en suspensión. A continuación, se añadió a cada pocillo 2 mL de DMEM, y se realizó la estimulación con mitógeno LPS (1,5 µg/mL), dejando pocillos sin estimular como control del estímulo. Después de 48 horas de incubación en estufa a 37ºC y atmósfera húmeda al 0,5% de CO2, el

sobrenadante de las células en cultivo fue recogido y almacenado a -80ºC hasta el momento de realizar las determinaciones. La cuantificación de adipoquinas en sobrenadante se llevó a cabo usando citometría de flujo, tal y como se realizó para la determinación de citoquinas en sangre, mediante el uso de Multiplex de Millipore específicos para IL-6, TNF-α, MCP1, adiponectina, leptina, PAI-1 y resistina.

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4. VALORACIÓN DEL ESTADO REDOX CELULAR