DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS HONGOS.

Para el estudio microbiológico de los hongos de una muestra, se debe realizar la observación directa al microscopio y obtener aislamiento del microorganismo en medio de cultivo.

Observación microscópica de hongos filamentosos.

Se pueden aplicar diferentes metodologías para la observación de las estructuras típicas del hongo, como: Montaje en portaobjetos o en rastrillo. Se coloca una gota del colorante Azul de Lactofenol sobre un portaobjetos, se toma la muestra con la ayuda de un asa micológica y se emulsiona y homogeniza la muestra con la ayuda de otra asa; se coloca el cubreobjetos encima y se procede a observar hasta el objetivo 40x. A menudo, el rastrillado de la colonia, rompe las delicadas estructuras de fructificación de los hongos filamentosos, alterando la observación de la posición y origen de algunas estructuras, como las esporas, dificultando así la identificación definitiva.

Preparación en cinta engomada o impronta. Se coloca una gota del colorante Azul de Lactofenol sobre la superficie de un portaobjeto. Utilizando cinta trasparente, presionar suavemente la parte adhesiva sobre la superficie de la colonia, procurando adherir una porción de micelio aéreo a esta. Pegar un extremo de la cinta sobre la superficie del portaobjetos, a un lado de la gota del colorante y con cuidado pegar la cinta con la muestra sobre la gota del colorante, para que el micelio aéreo se impregne con éste. Durante el procedimiento debe

evitarse la acumulación de burbujas de aire, para evitar la aparición de estructuras que dificulten la observación. Llevar al microscopio hasta objetivo 40x.

Técnica de cultivo en Microplaca o Microcultivo.

En algunas ocasiones, cuando ninguna de las preparaciones anteriores permite una observación satisfactoria de la muestra para el diagnóstico o cuando se desea el montaje sobre portaobjetos para estudios futuros, se recomienda esta técnica (Figura 9).

La técnica consiste en colocar en el interior de una caja de Petri estéril, unas varillas de vidrio estériles y sobre ellas una lámina portaobjetos. Las varillas evitan que la lámina portaobjetos haga contacto con el fondo de la caja de Petri. Luego sobre el portaobjetos se coloca un fragmento de 1cm2 del medio de cultivo sólido (PDA, Sabouraud, OGY, etc.), estéril. Una vez realizado este montaje, con un asa previamente flameada se siembra el hongo a analizar en la mitad de cultivo, se calienta rápidamente el cubreobjetos (para fijar la laminilla al agar), y se cubre la preparación con este. Este montaje, se dispone en una caja Petri con agua destilada humedeciendo un papel filtro estéril, el cual mantendrá una atmósfera húmeda (o papel humedecido con glicerina 10%). Después se procede a la incubación a la temperatura requerida y por el tiempo necesario (Figura 9).

Pasado el tiempo de incubación, se retira con cuidado el cubreobjetos (teniendo en cuenta que en este se encuentra adherido el hongo), se monta la laminilla con el hongo a estudiar sobre un portaobjeto con azul de Lactofenol (o sin colorante, dependiendo del objetivo de la observación), y se procede a su observación en fresco. También puede removerse el segmento de agar del portaobjeto original y teñirlo, procediendo a colocar un cubreobjetos y observando las dos preparaciones. Llevar hasta objetivo 40x.

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.

- 1 asa micológica. - 2 cajas Petri estériles. - 1 bandeja para tinción.

- 2 varillas de vidrio o pitillos plásticos. - 1 mechero Bunsen o de alcohol. - Azul de Lactofenol.

- 1 microscopio binocular compuesto. - Solución de Lugol.

- 3 portaobjetos estériles. - 5mL de glicerina 10%. - 3 cubreobjetos estériles. - 1 set de papel para óptica.

- 1 disco de papel filtro estéril (10 cm de diámetro).

- Cultivos fúngicos en agar PDA con 3 - 5 días de incubación. - 1 rollo de cinta adhesiva transparente.

- Toallas de papel desechable.

PROCEDIMIENTO.

1. De cada uno de los hongos y levaduras suministrados por el tutor, realice la caracterización macroscópica basándose en el aspecto del micelio o del crecimiento en las levaduras. Como marcadores de caracterización en las levaduras, utilice los aplicados a caracterización macroscópica de colonias bacterianas.

2. Para los hongos filamentosos: Micelio algodonoso, pulverulento, aterciopelado.

3. Pigmentación del crecimiento (pigmentos confinados al hongo o difundidos al medio de cultivo). 4. Consistencia: Dura, blanda, viscosa.

5. Realice el montaje en placas portaobjetos por las metodologías de toma de muestra con asa micológica o impronta, descritos en esta guía y utilizando como colorante, azul de Lactofenol.

6. Para la observación de levaduras, realice el montaje con solución de Lugol y lleve a objetivo de inmersión. 7. Del aislamiento asignado por su tutor, realice un microcultivo siguiendo las indicaciones dadas en esta guía. Incube a 25-28°C/3-5 días. Concluido el tiempo de incubación, realice el montaje y observación del hongo en el microcultivo, de la forma indicada en esta guía.

8. Realice la observación de los montajes indicados por el tutor en los microscopios dispuestos para ello. Grafique sus observaciones. Tenga en cuenta la bibliografía relacionada en la guía, para la utilización de claves en la identificación de los hongos observados.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS.

Ilustre todas las observaciones y realice el flujograma de cada experiencia realizada.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.

 Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.

 Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.

 VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.