Lectura e interpretación de los cultivos Pruebas de identificación
MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.
- 1 stomacher o licuadora.
- 1 recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para stomacher). - 1 balanza de precisión de 0.1g.
- Para preparación de muestras: Cuchilla y tijeras esterilizadas. - 9 pipetas de 1mL estériles.
- 1 pipeta de 10 mL estéril.
- 3 tubos con Agua Peptona 0.1% estéril. - 6 cajas Petri estériles.
- 3 cajas Petri con agar para Standard Plate Count (SPC). - 1 pipeta Pasteur pláticas estéril.
- 2 tubos con 10mL de Solución Salina 0,85%. - 1 microscopio binocular compuesto.
- 1 espectrofotómetro.
- 45 mL de agar SPC fundido y mantenido a 45-50°C. - 1 baño de agua mantenido a 45 - 50°C.
- 1 contador de colonias.
- 45 mL de agar OGY, Sabouraud, PDA (para conteo de Mohos y levaduras). - 1 calculadora.
- 1 tubo con cultivo bacteriano de 24h en Caldo Nutritivo. - 1 caja Petri con cultivo fúngico de 3d en agar PDA. - 2 asas de vidrio o de hockey estériles.
- 1 asa bacteriológica. - 1 cámara de Neubauer.
- 1 batería de patrones de McFarland. - 1 mechero Bunsen.
PROCEDIMIENTO.
Recuento en placa profunda (o técnica de Barry), y placa en superficie.
- Realice inicialmente los cálculos de diluciones decimales iguales a 10-1, 10-2 y 10-3, siguiendo las indicaciones de la guía y las indicaciones del tutor.
- Realice el proceso de dilución utilizando la muestra problema y el diluyente apropiado, guiándose por los cálculos realizados anteriormente. Recuerde utilizar solo material estéril en el procedimiento.
- Con las tres diluciones preparadas, proceda a inocular diferentes cajas Petri vacías y con agar SPC (siembra en profundidad y en superficie).
- Para la siembra en profundidad: De la dilución 10-1, tome con una pipeta estéril de 1mL de capacidad, 1mL y colóquelo en una caja de Petri estéril; repita este procedimiento en otra caja (cada dilución tendrá un duplicado), y de igual forma para las dos siguientes diluciones.
- Cuando haya sembrado todas las cajas (seis cajas en total), proceda a verter agar Standard Plate Count – SPC (Agar para conteo estándar), fundido y mantenido a 45°C aproximadamente. Homogenice cada caja, realizando movimientos circulares y en ocho, hasta que el agar inicie su polimerización.
- Para la siembra en superficie: De la dilución 10-1, tome con una pipeta estéril de 0,1mL de capacidad, 0,1mL y colóquelo en la superficie de una placa de agar SPC y con asa de vidrio, inmediatamente homogenice el inóculo por toda la superficie del agar; repita este procedimiento en otra caja (cada dilución tendrá un duplicado), y de igual forma para las dos siguientes diluciones.
- Recuerde que en la técnica en superficie, debe utilizar 0.1mL de la dilución y en la técnica en profundidad 1 mL.
- Incube invertidas las cajas a 37±2°C. Revise las cajas a las 24 horas de incubación y realice un recuento de las colonias visibles; incube nuevamente y revise a las 48h, realice el recuento (Estas temperaturas y tiempos se aplican para el análisis de bacterias aerobias mesófilas). Para el recuento de Mohos y Levaduras, aplique la misma técnica (profundidad y superficie), e incube invertidas las cajas a 25°C por 3 a 5 días (al igual que en el recuento de bacterias aerobias mesófilas, realice conteos a los 3 y posteriormente a los 5 días de incubación).
- Con los datos obtenidos en los recuentos, proceda a realizar los cálculos, de acuerdo a los volúmenes utilizados en la siembra y al factor de dilución de cada pareja de cajas.
- Reporte correctamente sus resultados del conteo de viables en UFC, por gramo o mililitro, de acuerdo a la naturaleza de la muestra analizada.
Recuento en cámara de Neubauer.
- Revise los conceptos relacionados en esta práctica y siga las instrucciones proporcionadas por su tutor. - Verifique que la muestra se encuentre diluida, para proceder a calcular la concentración de células por
mililitro de muestra.
- Monte la cámara de Neubauer en el microscopio, localice la cuadrícula para conteo y lleve a aumento de 10x. En este momento, debe observarse correctamente la cuadrícula y comprender la distribución y las áreas a contar.
- Coloque el cubreobjetos de la cámara al borde de la misma y cubriendo la cuadrícula de conteo.
- Homogenice en vórtex la muestra y con una pipeta Pasteur estéril, tome una alícuota de la misma; permita que por capilaridad, la cámara absorba la muestra.
- Verifique por observación, que la distribución de las células en la cámara sea homogénea. Si no es así, realice nuevamente el montaje de la cámara.
- Proceda a realizar el conteo, registre sus datos y calcule la concentración de células/mL. Ajuste de concentraciones bacterianas mediante Patrones de McFarland.
Método A:
- Revise los conceptos relacionados en esta práctica y siga las instrucciones proporcionadas por su tutor. - A cada patrón McFarland, determine su turbiedad mediante el uso de un espectrofotómetro. Tenga en
cuenta calibrar el equipo con un tubo que solo contenga agua destilada.
- Grafique las lecturas obtenidas de la siguiente forma: En el eje Y (ordenadas), los valores de densidad óptica (D.O.), registrados y en el eje X (abscisa), el número aproximado de bacterias representado para cada patrón McFarland.
- Concluida la calibración de los diferentes patrones, proceda a calcular la población de bacterias en la(s) muestra problema.
- Vierta asépticamente cada muestra problema en las celdas adecuadas para el espectrofotómetro y determine la D.O.; recuerde ajustar el “0” del equipo, con la muestra problema.
- Calcule la población bacteriana en UFC/mL.
Método B:
- Los patrones de McFarland para la preparación de suspensiones bacterianas de concentración conocida, pueden también ser elaborados a partir de parámetros visuales de turbidez.
- Primero, seleccione uno de los patrones McFarland, de acuerdo a la concentración necesaria de bacteria y homogenícelo totalmente (ya que los patrones se precipitan cuando no están en uso).
- Para el ajuste de la concentración por comparación con un patrón, tome asépticamente alícuotas del crecimiento de la bacteria en cajas Petri y con asa bacteriológica; transfiéralas a un volumen adecuado de solución salina fisiológica (en porciones pequeñas).
- Compare la turbidez del patrón con la turbidez de la muestra en preparación, colocando a contra luz o en un fondo oscuro los dos tubos, para realizar una correcta comparación visual.
- Detenga la adición de bacterias, cuando haya logrado la misma turbidez de la suspensión bacteriana con el patrón McFarland seleccionado.
- Registre correctamente la información de cada patrón y la concentración que corresponde a cada uno de ellos y a la muestra bacteriana preparada.
EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS.
1. Explique brevemente el proceso mediante el cual se realiza el recuento de microorganismos por la técnica de tubos múltiples (o técnica del Número Más Probable - NMP).
2. Defina el término inóculo.
BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.
Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.
Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.
VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009 PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España. SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.