MICROBIOLOGÍA
2015
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
ESCUELA PROFESIONAL ING. ENOLOGIA Y VITICULTURA
E ING. AGROINDUSTRIAL
FACULTAD DE INGENIERIAS.
DOCENTE: DR. BLGO. JUAN CARLOS QUISPE MEJÍA
CICLO: IV
INDICE
Contenido
Trabajo Práctico Nº 1 ... 5
Título de la práctica: El Laboratorio de Microbiología. Normas de Bioseguridad. ... 5
Trabajo Práctico Nº 2 ... 19
Título del práctico: Esterilización. Métodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de esterilización.20 Trabajo Práctico Nº 3 ... 35
Título del práctico: Preparación de materiales de uso en el laboratorio de microbiología. Lavado, preparación y esterilización. Medios de cultivo. Definición, clasificación, aplicación y preparación. ... 36
Trabajo Práctico Nº 4 ... 46
Título del práctico: Microscopía. Uso del microscopio. Observación de preparados montados ... 47
Examen microscópico. Examen en fresco. Técnicas de coloración de microorganismos. Coloración de Gram-Nicolle. Otras coloraciones ... 47
Trabajo Práctico Nº 6 ... 54
Título del práctico: Marcha microbiológica I. Técnicas de siembra. Siembras en medio líquido y en medio sólido en tubo (a un mismo nivel y en pico de flauta) y en placa (siembra masiva, agotamiento en superficie, agar volcado). ... 54
Trabajo Práctico Nº 7 ... 62
Título del práctico: Marcha microbiológica II.Lectura e interpretación de los cultivos. Pruebas de identificación. ... 62
Trabajo Práctico Nº 8 ... 71
Título del práctico: Medición y recuento de microorganismos. Recuento en placa y en cámaras. Técnicas de coloración de microorganismos. Coloración de Gram-Nicolle. Otras coloraciones ... 72
Trabajo Práctico Nº 9 ... 78
Título del práctico: Análisis Microbiológico de agua y bebidas. Técnica de filtración por membrana. Estudio de muestra problema ... 79
Trabajo Práctico Nº 11 ... 85
Título del práctico: Micología. Técnicas micológicas. Preparación de medios de cultivo. Repiques de hongos levaduriformes y filamentosos para su posterior identificación ... 86
Trabajo Práctico Nº 12 ... 93
Título del práctico: Hongos levaduriformes. Observaciones. Técnicas de identificación. Auxonograma y zimograma. Métodos convencionales y comerciales ... 94
Trabajo Práctico Nº 13 ... 100
Título del práctico: Hongos filamentosos. Observaciones. Técnicas de identificación. Colonia gigante. Microcultivos ... 100
Trabajo Práctico Nº 14 ... 113
Título del práctico: Morfología bacteriana. ... 114
Trabajo Práctico Nº 15 ... 124
Título del práctico: Tinciones simples y compuestas para bacterias ... 124
Trabajo Práctico Nº 16 ... 136
PRESENTACIÓN
La Microbiología, es una ciencia que viene desarrollándose crecientemente en referencia a otras ramas de la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de las observaciones que en 1669 realizo Robert Hooke, seguidas de un trabajo más explorativo en este contexto por Antonie Van Leeuwenhoek en 1670, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diferentes áreas de investigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.
El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se inicie en el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características morfológicas, nutricionales decrecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio.
Esta Guía Práctica está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.
Este manual contiene 14 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y hongos. El orden de presentación, corresponde al programa del curso Teórico-Práctico de Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de las carreras de Ingeniería en Enología y Viticultura e Ingeniería Agroindustrial impartidas en la Universidad Privada San Juan Bautista.
En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la comprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan con figuras y esquemas.
Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados en cuadros o esquemas, para que el alumno recopile sus observaciones. También se incluyen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante deberá de resolver consultando con los materiales bibliográficos.
El Laboratorio de Microbiología.
Normas de Bioseguridad.
Trabajo Práctico Nº 1
TÍTULO DE LA PRÁCTICA: El Laboratorio de Microbiología. Normas de Bioseguridad.
TEMA: Reseña histórica de la microbiología. Definición. Importancia de la microbiología. Microbiología
Industrial. Definición. Descubrimiento del mundo de los microbios. Origen del microscopio. Generación espontánea. Tindall, Pasteur, Koch. Conceptos generales de bioquímica y microbiología. Modernas industrias de fermentación. Los procesos en la producción de alimentos. Tratamientos biológicos de residuos.
OBJETIVOS A ALCANZAR:
Reconocer las normas de bioseguridad.
Identificar las señalizaciones y los Pictogramas de seguridad. Diferenciar las Fases R y las Fases S
Conocer los aspectos básicos de bioseguridad y reglas generales de trabajo para el desarrollo de actividades en el laboratorio de microbiología.
COMPETENCIAS RELACIONADAS:
Introducción a la Microbiología.
INTRODUCCIÓN
Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de esterilidad biológica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas). Es importante que los estudiantes que utilizan las estas instalaciones conozcan y apliquen todos los conceptos de bioseguridad. El Objetivo de estas normas es la Protección de los estudiantes en las instalaciones, reduciendo el riesgo en cada una de las etapas del proceso, así como evitar la contaminación de las prácticas desarrolladas, teniendo como propósito básico tener un ambiente de trabajo seguro y ordenado.
Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución por su potencial patogenicidad. La destrucción completa de todos los procedimientos analíticos como la preparación de medios de cultivo y otros materiales.
Es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.) contaminen nuestras muestras.
Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE SEGURIDAD.
MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.
Proyector. Guía Práctica
Señales de Bioseguridad
PROCEDIMIENTO
Se revisaran ínsitos en el Laboratorio:
Normas de ingreso y permanencia en laboratorio
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio, así como el que ingresa a las instalaciones debe responsabilizarse del cumplimiento de las normas de bioseguridad (EPPs).
2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.
3. Al INICIO y FINAL del procedimiento realizado en el laboratorio, limpie la superficie de trabajo con una solución desinfectante y ubique adecuadamente las sillas y materiales/equipos utilizados.
4. Las personas con cabello largo deben recogerlo al inicio de las actividades, así como utilizar: bata, cofia, tapabocas, guantes (si es necesario), y los equipos de protección según el nivel de riesgo biológico.
5. Emplee los equipos según las instrucciones disponibles en el laboratorio, así como, los protocolos o guías correspondientes a las prácticas. No manipule equipos sin la autorización respectiva y menos si no posee las destrezas para hacerlo.
6. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).
7. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
8. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
9. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
10. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común.
11. Todas las áreas deben estar rotuladas con la señal de riesgo biológico y el nivel de contención, y bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
12. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
13. 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al Docente.
14. Los libros y demás pertenencias personales deben ser ubicados en el lugar dispuesto para ello dentro del laboratorio. NO coloque sus pertenencias sobre las sillas o mesones de trabajo.
15. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión de laboratorio para evitar el ingreso de agentes contaminantes por las corrientes de aire.
16. Realice el transporte de muestras dentro o entre laboratorios en los contenedores apropiados (cajas herméticas o neveras transportables), con los cuales se eviten salpicaduras y sean de fácil desinfestación.
17. Al final de cada procedimiento, disponga el material contaminado o limpio en sus respectivos lugares pero NO sobre los mesones.
18. Evitar el contacto de la piel con materiales infecciosos o con potencialidad de serlo. El uso de guantes es adecuado para la manipulación de muestras o cultivos de patógenos. Si ha utilizado guantes, deberá desecharlos antes de salir del área de trabajo y NO tocar implementos, puertas, equipos o materiales con ellos puestos.
19. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Coordinador del laboratorio. 20. Se usarán gafas protectoras y máscaras faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. Debe
evitarse al máximo la formación de aerosoles durante el trabajo de laboratorio.
21. Cada estudiante o unidad de trabajo dentro del laboratorio debe contar con su equipo básico de trabajo (láminas portaobjetos, láminas cubreobjetos, jabón, tijeras, cinta de enmascarar, lápiz o marcador de vidrio permanente, toallas de papel, algodón, etanol, asas bacteriológicos y/o micológicas, guantes, pipeteador).
Introducción al trabajo en el laboratorio de bioquímica de productos agroindustriales: Pictogramas de Seguridad.
La señalización de seguridad es una medida preventiva complementaria a otras a las que no se puede sustituir. Ella sola no existe como tal, y es el último eslabón de una cadena de actuaciones básicas preventivas que empiezan con la identificación y evaluación de riesgos. Los riesgos residuales se evalúan ordenándolos según su importancia y planificando las correspondientes medidas preventivas
SEÑALES DE PROHIBICIÓN
FRASES R Y S.
Las frases “R” y “S” se refieren a los consejos de prudencia, relativos a la manipulación de productos peligrosos. La combinación de varias frases “R” o “S”, indican la concurrencia en un mismo producto de diversos riesgos y sus correspondientes consejos de prudencia. A continuación presentamos las frases mencionadas y algunas de sus combinaciones posibles
FRASES S
DESINFECCIÓN Y AGENTES DESINFECTANTES.
Desinfección, describe la destrucción de microorganismos presentes en la superficie de implementos, equipos y manipuladores, utilizando sustancias químicas denominadas desinfectantes (o antisépticos de acuerdo al uso). La desinfección no implica esterilización, pues no siempre se eliminan todos los microorganismos y sus estructuras de resistencia. Los desinfectantes son sustancias químicas aplicadas sobre objetos y superficies; los antisépticos son sustancias químicas aplicadas sobre la piel y mucosas. Algunos autores diferencian la desinfección de la desinfestación, de acuerdo al cuerpo a tratar.
Todo buen método de desinfección deberá cumplir las siguientes condiciones: (i) Eliminar el mayor número de microorganismos (al menos todos los patógenos), (ii) ser económico (iii) no debe ser corrosivo, tóxico o irritante para los tejidos y (iv) al menos ser soluble en agua.
Para el uso en laboratorios de microbiología, existen diferentes moléculas que pueden ser utilizadas con fines de desinfección (Tabla 1).
Agente
Mecanismo de acción
Aplicaciones
Halógenos:
Compuestos clorados: Hipoclorito de sodio (NaOCl)
- Efecto letal por la combinación rápida con proteínas.
- Los clorados reaccionan con el agua para formar ácido hipocloroso que es bactericida. - Oxidante, corrosivo para metales, de Degradación con el tiempo, se recomienda almacenarlas en frascos color ámbar, guardar las soluciones en frascos herméticamente cerrados, protegidos de la luz, el calor y la humedad; preparar la cantidad para uso.
- Purificación del agua. - Sanitización de utensilios en Industrias. - Microbicida. - En superficies se recomienda una concentración de 1%, con variaciones entre 1g/L y 10g/L. Componentes fenólicos: Fenol
- Altera la estructura de proteínas e induce su precipitación.
- Surfactante.
- Alteración de la membrana celular. - Irritante y altamente tóxico.
Recomendación para la Desinfección en solución al 5%.
Compuestos con base en Iodo: Tintura de Iodo, Solución Povidona-Iodo.
- No se tiene claro el mecanismo de acción.
Se presume que ocasiona la precipitación de las proteínas.
- Agente activo de superficies.
- La tintura de Iodo es empleada como antiséptico. - Efectivo contra esporas, hongos y virus.
Nota. ¿Cómo preparar la solución diaria de hipoclorito de sodio?
Ej.: hipoclorito comercial 5% y se desea preparar 1L (1000mL), con una concentración de 0.5% (5000 ppm). Aplique la fórmula: V= CdxVd Cc Donde, Vd: Volumen deseado Cd: Concentración deseada Cc: Concentración conocida. Entonces, V=0.5%x1.000c.c = 100c.c. 5%
Usted debe agregar 100mL de hipoclorito de sodio comercial 5%, a 900mL de agua, para un volumen final de 1L (1000mL), de una dilución al 0.5%.
Algunas dosis utilizadas para la desinfección de diferentes fuentes son: Agua potable (0.2 ppm); desinfección de manos e instrumental de acero inoxidable (50 ppm); camillas, mesas y camas (200 ppm); desinfección de pisos, mesones en baldosín, ropa, útiles de aseo, material plástico y material contaminado (p.e., V.I.H.) (500 ppm); y para la desinfección de material orgánico (5000 ppm).
Para un proceso de desinfección correcta, tenga en cuenta las siguientes recomendaciones: - Prepare la solución desinfectante diariamente para su uso.
- No utilice recipientes metálicos.
- Mantenga el producto desinfectante en un lugar seco y protegido de la luz. - Emplee la concentración recomendada por la casa comercial.
- No mezcle el desinfectante con otras sustancias. - Utilice guantes para su empleo.
NIVELES DE CONTENCIÓN O DE SEGURIDAD BIOLÓGICA.
El principal objetivo de la bioseguridad, es la contención. Este término se refiere a los métodos que hacen seguro el manejo de agentes infecciosos en el laboratorio, lográndose con esta contención, la disminución de los riesgos en la exposición del personal del laboratorio, de personas externas al laboratorio y del entorno.
De acuerdo a lo anterior, se han descrito cuatro niveles de “contención” o de “seguridad biológica”, los cuales combinan tres elementos de seguridad biológica: La técnica microbiológica, el equipo de seguridad y el diseño de las instalaciones.
Nivel de contención 1. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes que no producen enfermedad en el ser humano o animales. Es el utilizado comúnmente en los laboratorios de prácticas de las universidades o donde se emplean cepas no patogénicas (ej.: microorganismos utilizados en la industria alimentaria). Nivel de contención 2. Es de riesgo individual moderado y riesgo comunitario bajo. Agentes patógenos que pueden causar enfermedades en humanos y animales, pero con pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la comunidad, los animales o el medio ambiente (ej.: Staphylococcus sp., Salmonella sp., Toxoplasma sp., etc.).
Nivel de contención 3. Se debe aplicar este nivel, cuando se trabaja con microorganismos que ocasionan patologías graves, de tratamiento complicado y, que pueden ocasionar la muerte. Las principales medidas en este caso son la manipulación correcta dentro de cabinas de seguridad (ej.: Mycobacterium tuberculosis, Brucella abortus, Coxiella burneti, etc.). En estos casos, los procedimientos solo pueden ser desarrollados personal calificado.
Nivel de contención 4. De elevado riesgo individual y comunitario. Es el nivel requerido cuando se procesa o se sospecha de la presencia de un agente patógeno infectocontagioso, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento (o es poco fiable); para microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad (ej.: patógenos humano y animales).
Estructura Lógica del Informe del Laboratorio.
Introducción ( 1 pt )
Formulación de la Problemática (1 pt.)
Objetivo (s) (1 pt.)
Hipótesis (1 pt.)
Materiales y Equipos usados en la Práctica (1 pt.)
Metodología (2 pt.)
Resultados (2 pt.)
Análisis (mínimo de 2 o 3 trabajos o referencias científicas citadas) (3 pt.)
Conclusiones (3 pt.)
Referencias Bibliográficas. (1 pt.)
Cuestionario (4 pt.)
Ejemplo de un Informe de Laboratorio.
GENERALIDADES
1. Tamaño de papel : A4
2. Calidad de Papel : 80 gr
3. Tipo de letra : Arial 10, para los párrafos Arial 12, para los títulos y subtítulos. 4. Interlineado : 1.5
5. Diseño de Página : Márgenes
. CARATULA
El tamaño y la elección de los formatos son a elección del estudiante, pero ello debe de guardar el siguiente orden.
“Año de la Promoción de la Industria Responsable y Compromiso Climático” UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÌA EN ENOLOGÌA Y VITICULTURA O
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÌA AGROINDUSTRIA ___________________ TITULO DE LA PRÁCTICA DOCENTE: ALUMNO: ICA – PERÚ 2 015
.EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. a) ¿Porque son importantes tomar medidas de Bioseguridad en los Laboratorios?
b) Describe y cita algunos Pictogramas de Seguridad que identifiques en el Laboratorio
c) Menciona tres fases R y S que se deban usar en las Industrias Agropecuarias y/o Enológicas.
d) Liste al menos tres microorganismos representativos para cada uno de los cuatro niveles de contingencia en los laboratorios de microbiología, mencionando la importancia que representa para su área de formación.
BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.
Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.
Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.
VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009 PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España. SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.
Esterilización. Métodos. Controles. Uso de la autoclave
y de la estufa de esterilización.
Trabajo Práctico Nº 2
TÍTULO DEL PRÁCTICO:
Esterilización. Métodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de esterilización.TEMA:
Principales grupos microbianos. Aspectos taxonómicos moleculares según Carl Woose. Ubicaciónrelativa de los microbios dentro de los seres vivos. División de los seres vivos. Noción de clasificación microbiana. Principales grupos de virus. Bacterias. Levaduras. Mohos. Importancia de los microbios en el equilibrio de la biosfera. Ciclo del nitrógeno y del carbono
OBJETIVOS A ALCANZAR.
Reconocer las metodologías existentes para la desinfección de superficies e implementos del laboratorio. Aplicar algunos de métodos utilizados para la esterilización de medios de cultivo, materiales y accesorios
utilizados en el laboratorio de Microbiología.
Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología. Observará el efecto de control de la contaminación microbiana en el laboratorio.
COMPETENCIAS RELACIONADAS:
Introducción a la Microbiología.
INTRODUCCIÓN
Se denomina esterilización al proceso validado por medio del cual se obtiene un producto libre de microorganismos viables. El proceso de esterilización debe ser diseñado, validado y llevado a cabo de modo de asegurar que es capaz de eliminar la carga microbiana del producto o un desafío más resistente.
Como primer medida debemos realizar siempre una descontaminación, por la cual hacemos la remoción mecánica de microorganismo en objetos, dejándolos seguros para su manipulación.
Tenemos opciones por las cuales podemos elegir como erradicar en la mejor manera posible, los agentes infecciosos o patógenos:
- En la desinfección reducimos 3 a 5 Log la presencia de microorganismos iniciales.
- En la esterilización reducimos un mínimo de 6 Log la presencia de microorganismos iniciales.
Esta última opción es la más recomendable, cuando el tipo de material lo permite, porque reducimos riesgo de infecciones presentes en superficies, material, sustancia o ambiente.
Recordamos que este es un proceso validado para obtener un producto libre de todo microorganismo en forma latente o activa, causante de enfermedades o infecciones.
En la práctica resulta imposible probar la absoluta condición de esterilidad, por ello se asume que un producto está estéril cuando la probabilidad de que un solo microorganismo esté presente en forma viable sea igual o menor que 1 en 1.000.000, coeficiente de seguridad de esterilidad, utilizado a nivel mundial.
Debemos partir del conocimiento de la carga microbiana inicial para poder garantizar la eficiencia del procedimiento. La probabilidad de vida celular está en función del Número y tipo de microorganismo y de la letalidad del proceso de esterilización.
MATERIALES Y EQUIPOS
5 cajas Petri. 1 gradilla. 7 tubos de ensayo. 1 autoclave. 5 pipetas de 1mL. 1 horno de aire caliente. 2 erlenmeyer. 1 rollo de cinta de enmascarar. 1 rollo de papel kraft.
1 rollo de gasa. 1 rollo de algodón.
1 asa bacteriológica y una micológica. 1 mechero de Bunsen o de alcohol. 3 hisopos.
1 estufa eléctrica. 3 bajalenguas.
1 Pizeta con agua destilada.
VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN
Existen diversos tipos de controles durante el proceso de esterilización.
- Control físico: se controlan los parámetros del equipo, temperatura, humedad, presión y vacío en las distintas etapas del proceso.
- Control químico: se utilizan químicos que viran de color en contacto con agente esterilizante. Pueden ser externos, se colocan por fuera del paquete y distingue de un material procesado de uno que no. Los internos detectan la correcta penetración del agente esterilizante. Ej.: Prueba de Bowie Dick que visualiza la eficacia en la penetración de vapor en textiles.
- Control biológico: uso de dispositivos inoculados con bacterias.
Las esporas bacterianas presentan una gran resistencia frente a los antimicrobianos físicos y químicos debido a esa propiedad y a la facilidad de cultivar es que se utilizan las esporas de Bacillius, para monitorear y validar los procesos de esterilización de calor seco, húmedo, radiación y agentes químicos.
Incubamos a 65 ºC y leemos a las 24 y 48 hs., se deja el material en cuarentena y se libera una vez que dichos controles biológicos dieron negativos en el laboratorio.
CLASIFICACIÓN
MÉTODOS ESTERILIZACIÓN FÍSICOS CALOR HÚMEDO
El Autoclave es el equipo utilizado para este proceso. Funciona por vapor de agua saturado (vapor que está en contacto con el agua que lo genero), a presión superior a la normal. Mecanismo de acción: actúa por consecuencia de la liberación de energía calorífica 540 cal/g. El vapor actúa como transportador del calor, que produce muerte celular por coagulación del protoplasma. La desnaturalización de proteínas y enzimas se acelera con presencia de H2O (como la mayoría de las reacciones químicas). Es un proceso irreversible.
Es el método usado por excelencia, el más eficaz y más económico. No tóxico. En la actualidad encontramos en el mercado una amplia disponibilidad de equipos. Posee alto poder de penetración; actúa sobre formas vegetativas y esporas.
Depende de dos factores: - Temperatura
- Tiempo de exposición
Hay equipos de doble puerta, o de una puerta. Verticales u horizontales, automáticas o semiautomáticas. Construidas en acero inoxidable.
Formas de Uso:
T° 134° C a 3 atm. x 10 minutos: Para textiles de algodón, viruta.
T° 121° C a 2 atm. x 20 minutos: Instrumentos quirúrgicos, acero inoxidable, aluminio. La autoclave realiza distintos ciclos según el material a esterilizar.
- Con vacíos, como primer paso, garantizando la extracción de aire de la cámara, alternados con ingreso de vapor, que logre la penetración total en el interior del envoltorio. La cantidad de vacíos depende del material cargado: para textil son tres vacíos y para instrumental uno solo.
LA ESTERILIZACIÓN COMIENZA CUANDO LOS PARÁMETROS TEMPERATURA Y PRESION ALCANZAN EL VALOR ESTABLECIDO.
- Se produce una descarga por descompresión de la cámara y secado por vacío. Finaliza con ingreso de aire filtrado que nivela la presión interior con la exterior.
- Para líquidos se realiza un vacío inicial, controlada por una sonda testigo (termocupla), ubicada dentro de la carga, que censa la temperatura alcanzada en el líquido en la etapa de esterilización y finaliza con una lenta descarga y enfriamiento lento.
El material debe quedar seco, sin restos de humedad, que generaran la formación de colonias microbianas. Autoclave CHAMBERLAN: esteriliza a 120° C a 2 atm. o a 134°C a 3 atm. por 20 o 30 minutos, con purga inicial del aire. Está formada por una caldera de cobre, con una camisa metálica externa y en la parte inferior una corona de gas que emite calor.
El ciclo comienza con ingreso de vapor de agua en la cámara, este desciende al fondo de la misma y sale mientras ingresa más vapor en la parte superior.
Limitaciones:
No apto para polvos, líquidos oleosos, material sensible al calor o humedad (dispositivos eléctricos), ni instrumentos cromados.
Envoltorios para el instrumental:
- Papel: resistencia mecánica e integridad al agua. Gramaje: 60 g. Con permeabilidad selectiva (resistencia a la penetración de microorganismos y polvo) Normas IRAM 3003 para bolsas y papel.
- Bolsas: de papel grado médico, fuelle con apertura séptica, cara satinada hacia adentro y testigo químico impreso. Hay de diferentes medidas.
Validación:
- Control químico: Test Bowie and Dick, Hoja diseñada en papel flexible y porosidad adecuada, impreso con tintas sensibles e indelebles, permite detectar fallas en la penetración del vapor. Norma ISO 11140:1995. Cambio
de color uniforme en toda la superficie de la hoja de prueba para aceptar la validación. - Control biológico: medio de cultivo con Bacillus Sterothermophilus (esporas). Normas ISO 11138:1994
Tiras de Bacillus Stearothermophillus.
Tiras de Bacillus Stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado.
Tiras de Bacillus Stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado lectura rápida (2hs -4hs) Ampolla de vidrio con suspensión Bacillus stearothermophillus y medio de cultivo (ciclo líquidos exclusivamente) - Registro continuo o gráfico Temperatura - Presión / Tiempo.
Se realiza una carga en la que se coloca indicadores biológicos que serán analizados posteriormente al ciclo para verificar la eficacia.
CALOR SECO
Utilizamos para este método hornos o estufas, el agente esterilizante es el aire seco. Actúa por coagulación de proteínas y por oxidación de componentes celulares. Es económico, no toxico, no deja residuos.
La actividad del calor depende de dos factores: - Temperatura
- Tiempo de exposición
Y la efectividad depende de la difusión del calor. Se logra a:
-140°C por 3 horas. -160°C por 2 horas. -170°C por 1 hora. -180°C por 30 minutos.
La penetración del calor es lenta por lo que se requiere mayor tiempo de exposición. Se cuentan los minutos de esterilización a partir de que se alcanza la temperatura adecuada. Para enfriar se ventila con aire filtrado.
Aplicación
Sirve para sustancias oleosas o grasas, talco, vidrio, instrumental cromado, objetos que no pueden humedecerse. Limitaciones: Proceso lento con poco margen de seguridad. No se usa para textiles (peligro de incendio), ni para gomas, plásticos o agua.
Validación:
- Control físico: termómetro de máxima, termocuplas.
- Indicadores calorimétricos: son tiras o cintas adhesivas que viran de color a determinada temperatura. - Control biológico: tiras con Bacillus Subtilis (esporas). Normas ISO 11138: 1994.
Una autoclave es un aparato que cierra herméticamente y que en su interior desarrolla vapor bajo presión, el cual se presuriza y eleva la temperatura, proporcionando que el calor húmedo destruya los microorganismos.
Esterilización por calor seco
Temperatura (°C) Tiempo (minutos)
121 360 140 180 150 150 160 120 170 60 180 30
RADIACIONES
Se somete el material a dosis predeterminadas de radiaciones. Se utilizan dos tipos de radiaciones para esterilización:
-Rayos gama
Actúan lesionando los ácidos nucleicos. Es una radiación ionizante con alto poder de penetración, emitida por una fuente de Cobalto 60, bajo estrictas normas de seguridad. No produce radioactividad en los objetos esterilizados. Este proceso se realiza en plantas de radioesterilización.
Ventaja. No requiere monitoreo de rutina con controles biológicos. Aplicación: Vacunas, antibióticos.
-Rayos ultravioletas
Poseen acción germicida; no se considera esterilizante.
Interfiere en el metabolismo de los organismos induciendo ionización de los componentes vitales de la célula. Escasa penetración, absorbida a una longitud de onda 240/280 nm por los ácidos nucleicos alterando las bases genéticas. Esta radiación es producida por una lámpara de mercurio de baja presión que posee un tipo de cristales, que permite el paso de un rayo de luz, eliminando los microorganismos expuestos al mismo.
Aplicación: Purificación del agua. Elimina el 99% de bacterias presente el agua
MÉTODOS ESTERILIZACIÓN QUÍMICOS - líquidos – GLUTARALDHEIDO
Es el más ampliamente usado. Actúa por desnaturalización de proteínas y ácidos nucleicos.
Uso: Para esterilización actúa por inmersión en una dilución al 2% por 10 horas, con enjuague de agua destilada estéril para eliminar residuos tóxicos.
Amplio espectro con alta velocidad de acción: 1 minuto para bacterias, 10 minutos para virus y 3 horas para esporas bacterianas.
El personal debe estar provisto de guantes, barbijo, delantal y protector ocular.
APLICACIÓN
Materiales delicados que no soportan calor, ni procedimientos energéticos. Ej.: endoscopios, broncoscopios, etc.
PEROXIDO DE HIDRÓGENO
Actúa por inmersión en concentración del 6% por 10 minutos, descompone las catalasas de los tejidos. No deja residuos tóxicos; finalizado el proceso queda H2 y O2 .
Es un desinfectante de alto nivel y se lo considera esterilizante. En la actualidad se utiliza el Plasma de Peróxido de Hidrógenos, que desarrollamos en métodos gaseosos.
ÁCIDO PERACÉTICO
Excelente biocida, iguala al glutaraldheido, pero es menos estable.
Posee una acción desincrustante del material orgánico. Contiene una porción de surfactante, que remueve y mata el microorganismo.
• Esteriliza por inmersión en cubetas en concentraciones del 0.2 al 30% por 10 min. a 55°C / se enchufa y se programa los tiempos de exposición y lavados posteriores, se eliminan los residuos de este agente con 3 lavados posteriores (enjuagues de agua estéril). Todo el ciclo se registra y emite un registro que se guarda en el libro de proceso.
Estable 20 ciclos, se usa 24 horas después de preparado.
Sustancia corrosiva en un ph neutro, nocivo por inhalación, ingestión y contacto con piel. Los vapores son más pesados que el aire; produce explosión con calor.
Aplicación
Limitado a endoscopios, se debe lavar posteriormente a la exposición.
Se debe hacer uso inmediato del material. Control estricto del agua de enjuague. No permite almacenamiento por no tener envoltorio.
Validación
- Control Biológico: Tiras de Bacillus stearothermophillus.
MÉTODOS ESTERILIZACIÓN QUÍMICOS - gaseosos -OXIDO DE ETILENO – ALTO MARGEN DE SEGURIDAD DE ESTERILIZACIÓN –
Es un gas inflamable y explosivo en estado puro.
Se utiliza una mezcla del 12% Óxido de Etileno con 88% de Freón 12 o en la actualidad con 90% de Dióxido de Carbono y 10 % Óxido de Etileno, disminuye así la explosividad del Ox. De Etileno.
Actúa por alquilación de proteínas y enzimas de virus, esporas o bacterias (sustituye los átomos de hidrógeno lábiles por otros, grupo hidroxilo, carboxilo, etc.)
Forma de Uso:
Se utilizan cámaras que trabajan a bajas temperaturas, de 37°C a 55°C, con humedad de 33 -75% por 4 horas y una concentración de óxido en la cámara de 400-600 mg/ litro cámara.
Luego de la esterilización se necesita un periodo de aireación para eliminar el gas residual, ya que el material poroso puede absorberlo.
Se espera unos 40 días para la utilización del material.
Posee una excelente capacidad de difusión que amplía el margen de seguridad de la esterilización.
Aplicación: para materiales termo sensible, dispositivos y máquinas eléctricas, envases plásticos, prótesis e implantes. No apto para líquidos, ni textil (incluyendo gasas) por la humedad que retienen las tramas de la tela, que en contacto con el óxido de etileno reacciona formando un residuo difícil de resorber.
Como envoltorio se puede usar:
-Papel Normas IRAM 3106, papel Krafft blanco, puro monolucido peso 60gr/m2. -Fibras de celulosa largas que le dan resistencia a la tracción.
-Doble envoltorio: la externa se quita al ingresar al área aséptica, no es lo mismo doble papel son dos envolturas completas una en un sentido y la otra en sentido contrario.
-También puede usarse polipropileno que es una excelente barrera de envoltorio. Limitaciones
Riesgo potencial para el personal. La concentración máxima permitida es 1 ppm, durante 8 hs. de exposición, en el ambiente.
En el área de trabajo son necesarias 10 renovaciones de aire por hora.
Síntomas de toxicidad aguda: irritación de mucosas, cefaleas, vómito, diarrea, alteraciones electrocardiográficas. Puede inducir aberraciones cromosómicas. Tiene poder mutagénico, teratogenico y cancerígeno en humanos. • Ley 19567 modificado por Resolución 444/91 clasifica A2 POSIBLE CANCERÍGENO
• Disposición 33/90 de Dirección Higiene y Seguridad: Grupo II b cancerígeno en humanos Tiene un peso específico menor al aire por lo que estratifica en el piso.
Desventajas: Alto costo de los equipos e instalación apartada, con construcción antiexplosiva.
Requiere tiempos prolongados para el proceso de esterilización y desorción (eliminación del gas absorbido por el material)
El material requiere cuarentena. Se exige un control de toxicidad ambiental.
ETAPAS DEL PROCESO
Equipos hospitalarios: son de doble o simple puerta con distintas capacidades de volumen.
Equipos industriales: Hay adicionado un equipo de aireación más una instalación antiexplosiva. Pre acondicionamiento del material con humectación y precalentamiento.
Pasos de un ciclo:
- Acondicionamiento y humidificación, bajo vacío, ya que permite una penetración más profunda de la humedad, aumentando la dinámica de la difusión.
- Ingreso del gas - Exposición al gas - Evacuación
- Aireación en cámara separada
El equipo funciona a presión negativa (cuando es puro), por lo que el gas nunca sale de la cámara, ante una eventual pérdida de los burletes.
En caso de usar mezcla con gases inertes: freón y anhídrido carbónico su utiliza presión positiva, porque hay que introducir más gas, para llegar a lograr la concentración necesaria.
Gráfico de un ciclo ETO puro con inyección de gas inerte
Ejemplo de un ciclo ETO de mezcla Validación y monitoreo del proceso:
-Registro gráfico o continuo Temperatura - Presión / Tiempo.
-Registro gráfico o continuo Temperatura; RH % / Tiempo de cámara de Pre acondicionamiento (si es aplicable) -Registro gráfico o continuo Temperatura / Tiempo de Cámara de Aireación.
-Cálculo de concentración de óxido de etileno. - a) Peso esterilizante empleado / volumen cámara
- b) Cálculo indirecto por incremento de presión debido al ingreso de gas en la cámara. -Leak test o prueba de fugas (frecuencia recomendada semanal)
-Controles químicos interno y externo en cada paquete. -Controles biológicos en cada ciclo:
- Tiras de esporos Bacillus subtilis var. niger.
- Tiras de esporos Bacillus subtilis var. niger.+ Ampolla con medio de cultivo incorporado.
FORMALDEHÍDO
Actúa por alquilación de las enzimas celulares y proteínas estructurales.
No es explosivo, ni inflamable en concentraciones de esterilización. Sí es irritante a bajas temperaturas. Se utiliza en dilución en vapor de agua al 2-3% por 2 a 4 hs.
Temperatura constante a 50° C y Humedad 100% son las condiciones necesarias para provocar una esterilización.
Se usan cámaras similares a una autoclave de vapor húmedo, pero en este caso, en el vapor está disuelto el formaldehído.
ETAPAS DEL CICLO
- Vacío previo, con entrada y salida de vapor. Precalentamiento. - Pulsos de formaldehído y vapor (20 pulsos)
- Extracción del formaldehído, con vapor hasta eliminar el residual - Vacío de secado
- Aireación con aire filtrado. Aplicación
Se usa en material termolábil, látex, goma, plásticos. No apto para líquidos ni polvos. Posee una menor capacidad de difusión y penetración.
Limitaciones
Irritante y alérgeno para el operador. Sustancia tóxica y posiblemente cancerígena. Prohibido en Japón, Canadá y Australia. Empleo de normas de bioseguridad. Límite de exposición 0.75 ppm por 8 hs. de trabajo.
Validación
-Registro continuo o gráfico Temperatura-Presión / Tiempo. -Controles químicos internos y externos de cada paquete. -Controles biológicos en cada ciclo:
- Tiras de esporos Bacillus stearothermophillus.
- Tiras de esporos Bacillus stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado.
VAPOR DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
Se usa como agente esterilizante a bajas temperaturas y presión subatmosférica.
Recientemente se utiliza el plasma de peróxido de hidrógeno (estado entre líquido y gaseoso): Nube reactiva de electrones, radicales libres, partículas atómicas neutras y partículas cargadas positivamente generada por acción de radio frecuencia sobre vapor de peróxido de hidrógeno.
El Agente esterilizante es el PEROXIDO DE HIDROGENO, en estado de plasma. Se utiliza el equipo Sterrad, cámara hermética.
Este es un proceso rápido, no requiere aireación, dura 74 minutos, los más modernos tardan 35 minutos y no deja residuos con una concentración en cámara de 6 ppm de peróxido de hidrogeno. Con un nivel de seguridad (SAL) de 10 -6 (cumple nivel requerido: para esterilización).
Es seguro: para el paciente y para el personal que lo manipula. El líquido concentrado es irritante en piel y mucosas.
El proceso conserva más los materiales a esterilizar, no es agresivo, aumentando la vida media de los mismos. Equipo esterilizador simple puerta y distintas dimensiones de volumen.
No requiere instalación separada de otros equipos / procesos. Tiempo total del proceso: 60 - 75 minutos aproximadamente. Trabaja en Temperatura a 42° C y Humedad del 6 y 14%. Etapas de un ciclo
Vacío de la cámara, aumento de la temperatura y disminución de presión atmosférica. - Inyección de la solución de peróxido.
- Difusión del vapor generado.
- Generación del plasma: por ondas electromagnéticas producidas por un generador de radiofrecuencia. Al cesar la emisión de radiofrecuencia, el plasma se recombina para formar agua y oxígeno, sin dejar residuos tóxicos en el material.
- Aireación con ingreso de aire filtrado.
Ciclo plasma del Peróxido de Hidrógeno
LIMITACIONES
No se pueden esterilizar productos que posean celulosa, algodón, líquidos ni polvos. Es el método más caro desarrollado actualmente.
El material debe estar perfectamente seco sino aborta el proceso y se debe envolver en material poroso, bolsas o rollos Tyvek®.
Límite de exposición laboral 1 ppm por 8 horas trabajo y 5 ppm por 15 minutos en caso de fuga de la cámara. Validación y Monitoreo
Registro continuo Presión / Tiempo. -Cancelación automática del ciclo por: Presencia de humedad / Suciedad ocluida.
Retención de Peróxido de hidrógeno por materiales retentivos. -Controles químicos internos y externos en cada paquete. Controles biológicos:
Disponible: Tiras de Bacillus Stearthermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado.
MÉTODOS ESTERILIZACIÓN QUÍMICOS - MECÁNICOS FILTRACIÓN
Permite la remoción de todos los microorganismos presentes en líquidos o gases, reteniéndolos sobre la superficie de un material.
Filtros de membrana:
-Acetato de celulosa con poros de determinado diámetro, por ej.: 0,22 a 0.45 µm. -Retiene bacterias. No sirve para virus por su tamaño pequeño.
Actualmente se está reemplazando por una membrana hidrofílica fabricada de polietersulfona (PES), que es un polímero con una excepcional estabilidad y una mínima unión inespecífica de proteínas (comparable a las membranas de acetato de celulosa).
Estos filtros son desechables. Además de utilizarse en la esterilización de líquidos se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua. Filtros Hepa:
Los filtros H.E.P.A (High efficiency Particulate Air) son filtros descartables de medio filtrante seco y extendido que tienen una eficiencia mínima de 99,97 % (es decir una penetración máxima del 0,03 %) en aerosoles.
Los filtros U.L.P.A. (Ultra Low Penetration Air) son filtros con características similares a los filtros H.E.P.A. pero tienen una eficiencia mínima de 99,999 % (penetración máxima inferior al 0,001 %) para partículas de un tamaño entre 0,1 y 0,2 micrones. Se utilizan como filtros HEPA finales en sectores como el hospitalario, industria farmacéutica, industria alimenticia, industria química fina, industria veterinaria, cabinas de pintura, etc.
ALMACENAMIENTO DEL MATERIAL ESTÉRIL
Una vez que un material está estéril puede mantener esta condición si está protegido en la forma apropiada.
La duración de la esterilidad de un material no está relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su exposición al medio ambiente.
Los materiales estériles pierden su esterilidad:
-Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su transporte o almacenamiento.
-Al humedecerse el material de empaque. -No colocarlos sobre superficies mojadas.
-Mantener el área de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos. -Controlar la temperatura y la humedad de las áreas de almacenamiento.
La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26º C y la humedad relativa entre 30 y 60%.
La limpieza del área se realizará diariamente con utensilios propios, además de la limpieza general, una vez por semana, que debe ser estandarizada y evaluada.
El material se debe rotar, colocando en la parte posterior el de esterilización reciente, de manera que se utilice primero el que esté próximo a caducar.
CUESTIONARIO
1. Liste al menos tres microorganismos representativos para cada uno de los cuatro niveles de contingencia en los laboratorios de microbiología, mencionando la importancia que representa para su área de formación. 2. ¿Qué medidas podría tomar usted para verificar la efectividad de la esterilización en autoclave?
3. ¿Defina liofilización? 4. ¿Defina sonicación?
5. ¿Qué metodología de esterilización es la adecuada para cada una de las siguientes muestras? (i) Medios de cultivo sólidos contaminados con Salmonella sp., (ii) Muestras de agua residual doméstica, (iii) Hisopos utilizados en muestreo de manipuladores de alimentos, (iv) tejidos de procedencia animal y origen desconocido, (v), suelo, (vi) suelo inoculado con patógenos de plantas y, (vii) antibióticos.
BIBLIOGRAFÍA
Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.
Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.
VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009 PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España. SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.
Preparación de materiales de uso en el laboratorio.
Medios de cultivo
Trabajo Práctico Nº 3
TÍTULO DEL PRÁCTICO: Preparación de materiales de uso en el laboratorio de microbiología. Lavado,
preparación y esterilización. Medios de cultivo. Definición, clasificación, aplicación y preparación.
TEMA: Nutrición: Tipos de nutrición. Fisiología bacteriana: definición. Metabolismo microbiano, usos. División
del metabolismo. Clasificación metabólica de las bacterias. Fermentación. Respiración. Nutrición. Requerimientos nutricionales. Requerimientos de Nitrógeno. Requerimiento de Carbono. requerimiento del azufre
OBJETIVOS
- Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos, aplicando los conceptos básicos de nutrición y preparación de los mismos.
- Desarrollar en los estudiantes competencias en los puntos clave que deben tenerse en cuenta antes, durante y después de la preparación de un medio de cultivo.
- Preparar algunos medios de cultivo, líquidos o sólidos, siguiendo las instrucciones proporcionadas.
COMPETENCIAS RELACIONADAS:
Introducción a la Microbiología.
INTRODUCCIÓN
Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos nutrientes básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivarlos en el laboratorio.
Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio, mediante el uso de medios de cultivo artificiales, los cuales se encuentran disponibles en una gran variedad y los cuales en general aportan a los microorganismos:
1. Una fuente de carbono. El carbono es un componente esencial y central para conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus funciones. Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en dos grupo: Autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden cultivarse en medios que contengan únicamente compuestos inorgánicos (utilizan principalmente dióxido de carbono como carbono inorgánico). Los organismos heterótrofos en su lugar necesitan un suministro de carbono orgánico (por ejemplo glucosa u otro carbohidrato).
2. Una fuente de Nitrógeno. Elemento esencial para que la célula construya macromoléculas como: proteínas y ácidos nucléicos. Algunos microorganismos usan nitrógeno atmosférico, otros emplean sales de nitrato o de
amonio como compuestos inorgánicos, así como, otros requieren compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como los aminoácidos.
3. Elementos no metálicos. Iones no metálicos como el azufre y el fósforo. El azufre puede encontrarse en proteínas, sulfatos o como azufre elemental; mientras el que el fósforo puede encontrarse formando sales. 4. Elementos metálicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe+3). Llamados también micronutrientes,
oligoelementos o elementos traza. Encontrados en sales inorgánicas adicionadas a los medios y los cuales son tomados en bajas concentraciones por los microorganismos.
5. Vitaminas. Los microorganismos pueden tomarlas del medio ya elaboradas o iniciar procesos de síntesis de las mismas. Algunos microorganismos poseen una variedad de vías para sintetizar vitaminas; mientras otros, sintetizan un número muy limitado de ellas a partir de componentes del medio. Otros las requieren como suministro.
6. Agua.
7. Energía. Existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, los fotótrofos y los quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar), como única fuente de energía; y los quimiótrofos que, obtienen la energía por oxidación de compuestos químicos orgánicos o inorgánicos.
Las necesidades físicas involucran factores, como: Temperatura, pH y gases, los cuales se encuentran en un rango óptimo específico para cada microorganismo; por lo tanto, su variación puede acelerar o disminuir el crecimiento.
El profesional que desarrolla trabajos con microorganismos o con un microorganismo en particular, debe satisfacer sus necesidades nutricionales, con el objetivo de recuperarlo y hacerlo crecer adecuadamente. De manera general, estos medios pueden ser medios artificiales o medios químicamente definidos. Para los químicamente definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos puros que los conforman ya sean de tipo orgánico como inorgánico. Los medios artificiales están compuestos de un número limitado de sustancias complejas, como extractos de plantas o de animales cuya composición química exacta no se conoce. De acuerdo a lo anterior, los microorganismos en general pueden tomar los requerimientos nutricionales de los medios de cultivo, ya sean sustancias naturales o artificiales para multiplicarse
MEDIOS DE CULTIVO Y CLASIFICACIÓN.
El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el Laboratorio. Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal o, bien incorporada a un coloide en estado de gel), en las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s) (Tabla 1).
Propiedades de los medios de cultivo.
- Humedad. Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecación) puede llevar a la muerte del microorganismo.
- Fertilidad. Se refieren a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento bacteriano. - pH. Se refiere a los pH óptimos para el desarrollo bacteriano, indispensable para su aislamiento; variaciones
ácidas o alcalinas, pueden inhibir su crecimiento.
- Transparencia. Permite la observación bacteriológica, evidenciar morfológica y físicamente su crecimiento en medos de cultivo adecuado.
La presentación comercial de los medios sintéticos y deshidratados puede ser en polvo o granulados. En el mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o medios servidos en placas Petri o tubos.
Los medios de cultivo granulados, son medios de cultivo elaborados a partir de materias primas sometidas a molienda, mezclado, pulverización y granulación (aglutinación de la mezcla pulverulenta). Este tipo de medios tienen algunas ventajas frente a los medios tradicionales en polvo, como lo son:
- Reduce alergización o respiración de sustancias tóxicas por producción de polvo. - Menor adherencia a las paredes de los recipientes.
- Mayor facilidad en el pesaje.
- Mejor humectabilidad (grumos fácilmente solubles).
- No se produce separación de fases de los componentes del medio de cultivo en almacenamiento prolongado. - Mejor conservación.
Tabla 1. Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado físico, composición y su propósito
Estado/
Clasificación composición/ Descripción
objetivo
- Sólidos: 1.5 a 2.0 % de agar –agar.
SEGÚN SU ESTADO - Semisólidos: 0.5 % de agar –agar.
FÍSICO - Líquidos: No contienen agar –agar.
- Bifásico: Contiene fase sólida y fase líquida (listos para utilizar).
Utilizados para cultivar microorganismos tal y como se encuentran
- Naturales: en la naturaleza. Se usan con base a la experiencia y no a su
SEGÚN SU Composición. Ej.: Sangre diluida, leche, jugos vegetales, etc.
NATURALEZA O
- Sintéticos: De composición exactamente conocida. Los más utilizados son
COMPOSICIÓN Los medios comerciales deshidratados.
- Vivos: Contienen células u organismos vivos, como las células de riñón
de mono o huevos embrionados.
Con adición de sangre, suero o extractos
de tejidos de animales o plantas al caldo
Medios enriquecidos: o agar, proporcionando sustancias
nutritivas complementaria s para el crecimient o de microorganismos exigentes.
Con adición de algunas sustancias que
no permiten el desarrollo de un grupo de
microorganismos y sin afectar el
desarrollo de los grupos de interés. En
Medios selectivos*: principio se pueden seleccionar los
Aislamiento de microorganismos que se desarrollan en
medios orgánicos poco comunes, caso
SEGÚN SU microorganismos
en el cual se omiten otros compuestos
PROPOSITO
de
carbono.
Contienen reactivos químicos que traen
como resultado, determinado tipo de
Medios diferenciales*:
crecimiento bacteriano después de la
incubación
(observació
n de hemólisis,
coloraciones de las colonias y otras
reacciones indicadoras).
Para determinar el tipo de crecimiento
Medios para producido por los microorganismos, así
identificación: como, la capacidad para producir
cambios químicos.
*
Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas, es decir, permiten aislar microorganismos y revelan una reacción o cambio químico específico de metabolismo como: coloraciones de colonias o cambios de color del medio; es decir, selectivos y diferenciales al mismo tiempo.
Los medios de cultivo deshidratados deben ser conservados en lugares secos, protegidos de la luz, a una temperatura entre 15 y 30ºC, en envases bien cerrados y dispuestos preferiblemente de forma horizontal. Después de haber sido retirada una cantidad de medio de los envases, estos deben cerrarse firmemente. Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos cortos, máximo de una semana y lo más conveniente es almacenarlos a temperatura de refrigeración (máximo 4ºC); aunque algunos medios que contienen tioglicolato, se conservan mejor a temperatura ambiente y protegidos de la luz por un tiempo máximo de 4 días. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento, los medios deshidratados conservan sus cualidades durante el tiempo indicado y hasta la caducidad impresa en la etiqueta del recipiente.
A los medio de cultivos se les realiza una prueba de esterilidad, ya sea cuando están deshidratados (Ecométrico), o preparados. En el último caso se toma del lote una muestra no inferior al 5%, incubándose estas muestra a 37ºC/24h. Finalizado el tiempo de incubación se observa si presentan crecimiento microbiano con el fin de descartar los lotes de medios contaminados.
PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Es un proceso clave en el trabajo de rutina e investigación microbiológica. Para obtener un producto final bien terminado (medio de cultivo), deberá contarse con la habilidad, destreza, conocimientos básicos en fisicoquímica y microbiología. En términos generales, un medio de cultivo puede ser preparado correctamente siguiendo las indicaciones relacionadas a continuación:
1. Disolución del medio de cultivo deshidratado. Se debe emplear agua limpia, recién destilada o desmineralizada y con pH lo más cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para que el medio sea agitado con facilidad. Inicialmente se añade la mitad de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea; después, se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, pero no debe calentarse más de lo estrictamente necesario. Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser sometido a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible prestar atención en su disolución completa, esto se confirma cuando al agitar no se adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partícula de agar o de medio y la solución fluye libremente. Si la preparación es de más de 2 litros, se recomienda desleír el medio de cultivo en una décima parte de la cantidad total de agua y dejarla remojar durante 15 min.; simultáneamente, calentar a ebullición el agua restante y agregar ésta agua con constante agitación al medio remojado. Calentar hasta su completa disolución.
2. Esterilización. Antes de su esterilización y después de su completa disolución se debe repartir el medio en los recipientes definitivos o en los que se lleve a cabo el trabajo de investigación, excepto si corresponde a cajas de Petri. La esterilización, si así lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en autoclave a 121ºC/15 libras de presión/15min. Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (válvula abierta), y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar
los recipientes rápidamente a temperatura de vertido entre 45 y 50º C, así se evitará alterar el medio de cultivo. 3. Vertido en placa. Previamente, remover el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido circular para
entremezclarlo de manera uniforme; verter el medio a las cajas Petri a la temperatura de vertido, evitando la formación de humedad en la tapa de la caja. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan Abanicando brevemente con la llama no luminosa de un mechero de Bunsen. Recuerde que el proceso de
servido de las cajas debe realizarse en un cuarto estéril o en cámara de flujo laminar.
4. Tubos de agar inclinado (bisel o pico de flauta), y sin inclinación. Los tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada de tal forma que se forme una placa de aproximadamente 3cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones (Agar inclinado, pico de flauta o bisel). En los casos en los cuales se requiere el medio sin inclinar, estos deben dejarse solidificar en posición vertical sobre una gradilla.
Posibles defectos en la manipulación y preparación de medios de cultivo.
Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una conservación del medio de cultivo en ambiente exclusivamente húmedo; puede ser la causa de envases abiertos por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase después de su uso o por último que, el medio de cultivo se encuentra vencido (ver fecha de vencimiento). Se recomienda después de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posición horizontal. Desviación del pH. Causado por utilización de agua no neutra, envases mal cerrados, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación o medio pasado de fecha de vencimiento.
Turbidez. Precipitación causada por uso de recipientes sucios, sobrecalentamiento del medio, pérdida de agua por evaporación en el medio o por no disolución completa del agar-agar.
Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporción inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolución del agar-agar e ineficiencia en la agitación.
Medios de cultivo contaminados. Por esterilización deficiente o contaminación posterior a su preparación (vidriería no estéril y/o contaminación en etapa de servido de los medios).
Colonias inconcretas o desleídas. Causada por superficies húmedas de los medios y/o por demasiado inóculo en la siembra.
CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO.
Medios simples.
Agar Nutritivo: Contiene extracto de carne, peptona y agar-agar.
Caldo Nutritivo: Contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y Cloruro de Sodio al 0.5% (Ej.: Caldo BHI (Brain Heart Infusion/Infusión Cerebro Corazón), Caldo TSB (Caldo de Soya Tripticasa), y Caldo Nutritivo).
Agar Base Sangre: Medio sólido que contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7%; usado para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemolítica.
Medios enriquecidos.
Agar Sangre: Al medio Agar Sangre se le adiciona sangre de conejo desfibrinada al 7% estéril, cuando este tiene una temperatura de 45ºC y luego de su esterilización (la fuente de sangre debe ser estéril).
Agar Chocolate: Consiste en un agar sangre que antes de su solidificación se lleva a 100º C/1min., (llevar a ebullición); así, se rompen los glóbulos rojos y el medio toma un color café. Se usa para el aislamiento de Haemophilus spp., y Neisseria spp.
Medio de Tioglicolato: Permite el aislamiento de aerobios tolerantes y anaerobios. Debe conservarse en la oscuridad y en tubos tapa rosca de manera que, la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie del medio.
Medios selectivos y diferenciales.
Agar MacConkey: Medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa y rojo neutro como indicador de pH (evidencia la fermentación de la lactosa por el cambio de color). Agar SS (Salmonella-Shigella): Contiene peptona, lactosa, bilis de buey desecada, citrato sódico, tiosulfato sódico, citrato de hierro (III) y amonio, verde brillante y como indicador de pH Rojo neutro, que evidencia la fermentación o no de lactosa. Las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras y las de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. También pueden determinarse microorganismos formadores de H2S, por la formación de un centro negro en la colonia.
Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Contiene colorantes que impiden el crecimiento de bacterias Gram-positivas. E. coli crece formando colonias con brillo metálico característico, por la cristalización de la Eosina. Medio de Telurito: Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus y Listeria. El Telurito de potasio al 2%, es reducido por las Corynebacterias reductoras, apareciendo colonias de color gris-negro.
Medio de Sabouraud: Medio utilizado para el aislamiento de mohos y levaduras. Contiene dextrosa, peptona o maltosa y con pH entre 5,0 y 5,5, inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos por efectos de la acidez del medio.
Medios de transporte.
Mantienen viables los microorganismos presentes en una muestra antes que esta se procese; los conserva evitando su multiplicación y muerte.
Medio de Stuart: Se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos muestreados con escobillón estéril (hisopos).
Medio de Buffer Glicerinado: Permite el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos. Se ha observado que, mantiene la viabilidad de Shigella.
Medios bioquímicos diversos.
Son aquellos que revelan las características bioquímicas particulares de las bacterias, como: TSI (Agar Hierro tres azúcares), Citrato de Simmons, SIM (Agar Sulfuro Indol Motilidad), Caldo MR-VP (Rojo de Metilo-Voges Proskauer), Caldo Malonato, Caldo Rojo de Fenol + Carbohidrato, Úrea, LIA (Agar Lisina Hierro), etc.
Comercialmente, pueden encontrarse sistemas multipruebas para evaluación bioquímica de microorganismos, con 10 o más parámetros que permiten una rápida y precisa identificación de los rasgos metabólicos del microorganismo y su consiguiente identificación (Sistemas Crystal y API).
Materiales y equipos. - 2 cajas Petri estériles. - 2 tubos de ensayo estériles. - 2 tubos taparosca estériles. - 2 pipetas de 10mL estériles.
- 2 erlenmeyer de 50 y 250mL (o dos botellas para preparación de medios de cultivo). - 1 autoclave.
- 1 rollo de cinta de papel. - 1 rollo de gasa.
- 1 rollo de algodón.
- 1 pote de medio de cultivo deshidratado (simple, enriquecido, selectivo y diferencial). - 1 mechero Bunsen. - 1 estufa eléctrica. - 1 balanza de precisión. - 1 espátula. - 500mL de agua destilada. - 2 probetas de 50 y 100mL.
- 2 pesasales o recipientes para pesaje. - Alcohol 70%.
