En este trabajo se evaluó la concentración de alicina en el extracto acuoso y en el polvo de ajo y el efecto de la adición del polvo de ajo sobre la prevalencia e intensidad media parasitaria, las variables productivas, hematológicas y la química sanguínea de juveniles de jurel (S. lalandi) cultivados bajo condiciones experimentales y desafiados con Z. seriolae.
Al trabajar con productos naturales, es muy importante conocer la concentración de los principios activos que lo componen, aún más si estos son altamente inestables. En el extracto de ajo, se observó que la concentración promedio de alicina fue de 0.047 ± 0.003% y en el polvo de ajo fue de 2.79 ± 0.005%. El contenido promedio de alicina en el polvo del ajo utilizado en este trabajo fue similar al de otros ajos cultivados en distintas zonas geográficas de Irán, que van desde 1.75 ± 0.1 hasta 13.03 ± 1.7% de alicina (Baghalian et al., 2005).
Al adicionar el polvo de ajo a las partículas de alimento usando aceite como producto adherente, hay que tomar en cuenta que el fitobiótico se encuentra en contacto más directo con el agua del cultivo, lo que puede propiciar pérdidas por lixiviación, en contraste con lo que ocurre cuando el ajo se adiciona junto con las materias primas al momento de producir el alimento. Por esta razón, es necesario hacer pruebas de lixiviación, en particular para cuantificar las pérdidas de alicina. En este sentido, Militz et al. (2013) cuantificaron una pérdida menor al 3% de alicina en el alimento suplementado con extracto de ajo a una dosis de 150 ml/kg; en el presente bioensayo, se cuantificó a los 30 segundos una pérdida por lixiviación equivalente al 28 y 65% del contenido inicial de alicina para las dosis de 2 y 4% de polvo de ajo, respectivamente. Probablemente, esta diferencia en la lixiviación de alicina tenga que ver con la forma en la que se adicionó el ajo, ya que Militz et al. (2013) lo mezclaron con el resto de los ingredientes previo a la pelletización de la dieta y en el presente trabajo con jurel, se hizo por medio de un recubrimiento externo del pellet con aceite de pescado.
El aceite derivado de pescados y mariscos se utiliza en forma común como agente adherente para el suministro de ciertos fármacos en el alimento de los peces. Duis et al.
(1995) observaron que a los 15 minutos de que las partículas de alimento recubiertas con antibióticos como la oxitetraciclina, la amoxicilina, el trimetoprim/sulfametoxazol y ácido oxolínico permanecieron en el agua, se registró una pérdida del 8.4 al 67.3% del fármaco, y que utilizando alginato de calcio la lixiviación se registró del 0 al 24%, por lo que esta última opción podría ser evaluada en futuros bioensayos relacionados con el recubrimiento externo del alimento con el polvo de ajo.
Es importante resaltar que durante el desarrollo del experimento, no se observó que los peces rechazaran el alimento suplementado con polvo de ajo en ninguna de sus proporciones (2 y 4%), ya que después de la alimentación no se encontró alimento en el fondo de los tanques; de manera similar, Militz et al. (2013) y Martins et al. (2002) observaron que la adición de ajo al alimento, no disminuye su palatabilidad.
En las variables productivas, el peso y longitud de los peces, no fueron afectados por la dosis de ajo (2 y 4%) incluida en el alimento, lo que también se observó en Piaractus mesopotamicus (infestado con Anacanthorus penilabiatus), el cual recibió alimento suplementado con disulfuro de alilo por 15, 30 y 45 días (Martins et al., 2002) y en
Oncorhynchus mykiss (infectado experimentalmente con Aeromona hydrophila) al proporcionarle alimento con alicina comercial durante 14 días (Nya et al., 2010). La inclusión de ajo o de alguno de sus componentes, también ha producido un aumento del peso final. En Oreochromis niloticus, la adición del 3% de polvo de ajo a la dieta produjo un incremento del 21% a los 60 días de alimentación (Felicitta et al., 2013) y al agregar el 1%, el incremento en peso fue del 12.94% después de 60 días (Mehrim et al., 2014). El índice de condición no fue afectado por los tratamientos, pero es notable una disminución después de la infestación experimental. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Nya et al. (2010), quienes expusieron a O. mykiss a la alicina pura, la cual no afectó el factor de condición; en contraste, en Acipenser ruthenus se observó un mayor índice de condición cuando los organismos recibieron una dieta suplementada con 2% de polvo de ajo por 12 semanas (0.52 ± 0.08) (Lee et al., 2014).
Un análisis de la dinámica estacional de la carga parasitaria de Z. seriolae en Seriola dumerili, capturado del medio silvestre, indicó que a una mayor longitud del hospedero, la carga parasitaria y el índice de condición eran menores, este resultado estaba muy relacionado con la temperatura del agua, ya que en los meses más cálidos (abril-octubre), cuando la temperatura del agua incrementó de 17.3 a 27 °C se registró una disminución del peso y un aumento en la intensidad y abundancia parasitaria (Repullés-Albelda et al.,
2013). Lo contrario a esta observación, se documentó en Lutjanus guttatus parasitado condactilogíridos (Del Rio-Zaragoza et al., 2010) y en S. dumerili con Z. seriolae (Montero
et al., 2004), en los cuales no se observaron efectos en el índice de condición debido a la intensidad parasitaria.
En los organismos, la evaluación del índice hepatosomático está relacionado con el contenido de grasa en el hígado, es específico para cada especie y en los peces teleósteos oscila entre 1.09 y 5.65% (Ando et al., 1993; Oguri, 1978, 1985). En Seriola quinqueradiata, el valor del índice es sensible al contenido energético y proteico de la dieta y puede variar de 1.40 a 1.70% (Shimeno et al., 1985). En el presente trabajo con
S. lalandi, se observó que después del periodo de alimentación experimental, el índice hepatosomático fue mayor en el grupo control (1.41 ± 0.20%), en contraste con los tratamientos dosis baja y alta (1.15 ± 0.18 y 1.21 ± 0.21). Estos resultados son similares a lo documentado en O. niloticus que recibió alimento suplementado con ajo por 3 meses, donde el índice hepatosomático fue mayor en el control sin ajo (1.90 ± 0.09%), en comparación con los tratamientos con ajo fresco (40 g/kg de la dieta), aceite de ajo (150 mg/kg de la dieta) y polvo de ajo (32 g/kg) (de 1.58 a 1.63%) (Metwally, 2009). En el esturión, A. ruthenus, este índice fue disminuyendo a medida que aumentaba la concentración de polvo de ajo, de 1.87 ± 0.05% con 0.5% de polvo de ajo a 1.71 ± 0.11% con 3% de polvo de ajo (Lee et al., 2014). Por el contrario, en O. niloticus no se observaron diferencias entre los diferentes niveles de suplementación de ajo (Shalaby et al., 2006).
El efecto del ajo en la disminución del índice hepatosomático, está relacionado con la disminución de los niveles de lípidos en la sangre e hígado de los peces, ya que este fitobiótico inhibe las enzimas involucradas en la síntesis de colesterol y ácidos grasos e
incrementa el uso del colesterol previamente sintetizado (Al-Salahy y Mahmoud, 2003; Metwally, 2009; Cardelle-Cobas et al., 2010; Gao et al., 2013; Lee et al., 2014).
La presencia de parásitos en los organismos de cultivo son un problema por resolver y complica el desarrollo del ciclo productivo (Bondad-Reantaso et al., 2005). Específicamente en el jurel, se ha reportado la incidencia de parásitos monogéneos, entre los que resalta Z. seriolae. Este organismo parasita a los jureles silvestres y a los cultivados, se han descrito intensidades parasitarias de 5 a 731 parásitos/pez y la magnitud de la infestación se ha relacionado positivamente con la temperatura del agua (Montero et al., 2004; Mansell et al., 2005; Lia et al., 2007; Lu et al., 2012; Repullés- Albelda et al., 2013).
La terapia utilizada para remover y eliminar el parásito branquial Z. seriolae se ha restringido al uso de productos como el prazicuantel, el peróxido de hidrógeno y la formalina (Sharp et al., 2004; Mansell et al., 2005; Williams et al., 2007). En otras especies se ha utilizado el ajo contra parásitos como en Lates calcarifer (Militz et al., 2013), Poecilia reticulata (Fridman et al., 2014) y P. mesopotamicus (Martins et al., 2002), y para el tratamiento de infecciones bacterianas en O. mykiss (Nya y Austin, 2009; Nya et al., 2010), O. niloticus (Aly et al., 2008, 2010), Dicentrarchus labrax (Colorni et al., 1998) y L. calcarifer (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). En S. lalandi no se ha documentado el uso de este fitobiótico como agente para el tratamiento de ectoparásitos o de infecciones bacterianas.
Los resultados de este trabajo indican que el consumo del alimento enriquecido con dos concentraciones de polvo de ajo (2 y 4%) no redujo en forma significativa la intensidad media del parásito Z. seriolae. En contraste, en L. calcarifer, P. reticulata y P. mesopotamicus se observó una reducción de los parásitos Neobenedenia sp. (Militz et al., 2013), Dactylogyrus sp. (Fridman et al., 2014) y A. penilabiatus (Martins et al., 2002), respectivamente. Es probable que estas diferencias se deben a que en S. lalandi se utilizaron las concentraciones establecidas por Fridman et al. (2014) en P. reticulata, por lo que será necesario determinar la concentración de ajo adecuada para el jurel.
Z. seriolae no fue el único parásito quese observó en el periodo comprendido del día 33 al 61 de experimento, la presencia de un dinoflagelado parásito, similar a Amyloodinum ocelatum, proliferó solamente en las branquias de los jureles. Este microorganismo es un ectoparásito que se encuentra en forma común en la piel y branquias de organismos marinos y ocasiona problemas sanitarios debido a su rápida reproducción, por su ciclo de vida directo, que se caracteriza por tres estadios: el trofozoíto, que es la fase adulta y se adhiere al epitelio del hospedero a través de una estructura tipo rizoide, con la que se mantiene adherido hasta que madura y se desprende; el tomonte, que es el estadio reproductivo, se encuentra en el fondo marino y se divide para formar las dinosporas, que son el estadio de vida libre y el único reconocido como susceptible a los tratamientos antimicrobianos (Francis-Floyd y Floyd, 2011; Noga, 2011; Woo y Buchmann, 2012). Es importante destacar que en S. lalandi, la presencia del dinoflagelado muy probable A. ocelatum, se suscitó cuando se propició que los jureles se parasitaran con Z. seriolae, al incrementar la temperatura (28 °C) y deteriorar la calidad del agua. En el estudio de Brown (1934), se documentó que las condiciones térmicas (23-27 °C) favorecen la proliferación de A. ocelatum, y en algunas especies, la infección se restringe a las branquias y su especificidad es muy baja, en este sentido, Colorni (1994) reportó que A. ocelatum no solo parasitó a Sparus aurata sino también a Neobenedenia melleni que ya infestaba a este pez.
En los últimos días del cultivo de los jureles, se observó una disminución del consumo de alimento, un incremento en la frecuencia de los movimientos operculares y apertura de la cavidad oral, una disminución de la actividad y un comportamiento de fricción sobre las superficies de los estanques. Estas características conductuales también fueron observadas por Brown (1934) y Lawler (1980) en presencia de A. ocelatum y Montero et al. (2004), Lia et al. (2007) y Lu et al. (2012) en infestaciones con Z. seriolae. En este trabajo no se hicieron observaciones del tejido branquial a nivel histológico en los jureles, pero en hospederos de Z. seriolae y A. ocelatum se ha observado palidez branquial, hipersecreción de mucus en las branquias, hiperplasia e hipertrofia del epitelio branquial y fusión lamelar, inflamación, hemorragia y necrosis del tejido branquial, lo que desencadena una disfunción respiratoria, que impide el intercambio de gases, por lo tanto
les ocasiona letargia y finalmente la muerte de los organismos (Lawler, 1980; Paperna, 1980; Grau et al., 2003; Montero et al., 2004; Mansell et al., 2005; Lia et al., 2007; Lu et al., 2012).
La muerte del hospedero sobreviene por la imposibilidad de intercambiar gases a través de las branquias por Z. seriolae (Grau et al., 2003; Montero et al., 2004; Lia et al., 2007) y por A. ocelatum en los cultivos de S. dumerili (Aiello y D’Alba, 1986), Rachycentron canadum (que también estaba parasitado por Neobenedenia melleni) (Moreira et al., 2013) y en Scophthalmus maximus (Saraiva et al., 2011). Lawler (1980) estudió diferentes especies de peces y menciona que cuando una infestación es muy severa, la muerte puede ocurrir en un plazo de 12 horas posteriores a la introducción de los peces a estanques con altas concentraciones de dinosporas de A. ocelatum.
En este experimento, posterior a la infestación parasitaria, se registró una mortalidad entre los diferentes tratamientos, del 58.33 ± 50.52% de los organismos del grupo control, 29.17 ± 19.09% del grupo dosis baja y del 29.17 ± 26.02% en el grupo dosis alta, sin ser significativamente diferentes. Los estudios con otras especies donde se utilizaron dietas suplementadas con ajo, demuestran que este fitobiótico tuvo una respuesta en mejorar la supervivencia ante desafíos bacterianos en peces como L. calcarifer cuando recibió 5, 10, 15 o 20 g/kg de polvo de ajo en la dieta durante cuatro meses (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). Resultados similares fueron documentados en O. mykiss con la adición de 0.5 y 1 g de polvo de ajo por cada 100 g del alimento durante 14 días (Nya y Austin, 2009), en
O. niloticus expuesto con el 1 y 2% de ajo adicionado al alimento durante uno y dos meses (Aly et al., 2008) y con el 3% durante 3 meses (Aly y Mohamed, 2010). Contrario a esto, Aly et al. (2010) no observaron diferencias en la mortalidad entre las tilapias (O. niloticus) tratadas con la dieta enriquecida con y sin ajo. Por lo anterior, es posible que en el jurel las dosis de polvo de ajo utilizadas (2 y 4%) no hayan sido las adecuadas para eliminar a Z. seriolae.
La terapia preventiva o correctiva con ajo no se ha documentado para A. ocelatum, pero si para otros protozoarios que parasitan piel, aletas y branquias, donde el tratamiento solamente ha resultado efectivo cuando se suministra en forma de baños de inmersión.
En este sentido, el tratamiento de O. niloticus con baños con aceite de ajo a una concentración de 2, 2.5 y 3 ppt por 4 h para el control simultáneo de Trichodina sp. y
Gyrodactylus sp. eliminó la presencia de estos parásitos (Abd El-Galil y Aboelhadid, 2012). De la misma forma, en Poecilia latipinna el tratamiento en baños con extracto de ajo a una concentración de 0.1 g/l, resultó efectivo para la eliminación de Ichthyophtirius multifilis hasta el quinto día de tratamiento y con una mortalidad de 11%, en contraste con el 28% obtenido con el tratamiento con Matricaria chamomilla (Gholipour-Kanani et al., 2012). Un tratamiento similar en O. niloticus eliminó a Trichodina sp. con 800 ppm de extracto de ajo por 48 h (Chitmanat et al., 2005)y un tratamiento por 24 h de 200 ppm de ajo crudo, logró la remoción de Trichodina jadranica en Anguilla anguilla (Madsen et al., 2000). En pruebas in vitro con I. multifiliis se documentó un efecto letal con 62.5 mg/l de extracto de ajo durante 15 h (Buchmann et al., 2003).
El mecanismo de acción del ajo como agente antiparasitario no está definido, pero se conoce que tiene diferentes efectos terapéuticos: a) antimutagénico, que se logra por la inhibición de la división celular e inducción de la apoptosis; b) antimicrobiano, mediante la inhibición del crecimiento de las bacterias, y c) la inmunoestimulación por la liberación de citosina proinflamatoria y por la estimulación de las células citolíticas (Focke et al., 1991; Salman et al., 1999; Cardelle-Cobas et al., 2010; Gao et al., 2013). El efecto antiparasitario del ajo puede depender de la forma en la que se procesa y suministra, ya que Peña et al. (1988) observaron que al agregar ajo fresco picado en el agua de los estanques de cultivo de Cyprinus carpio, se eliminaron completamente los huevos y adultos de Capillaria sp.; la adición del extracto de ajo en hexano disminuyó la carga parasitaria y en contraste, la adición del extracto acuoso no surtió efecto como agente antiparasitario.
Debido a que la inmunoestimulación se menciona entre los efectos beneficiosos del ajo, como parte de este trabajo se realizó el análisis de los componentes sanguíneos, los cuales son útiles para conocer el estado fisiológico de los organismos, ya que las alteraciones de los valores normales se pueden relacionar con diferentes patologías (Mehrim et al., 2014). En relación al efecto del ajo en la hematología y química sanguínea del jurel S. lalandi, el intervalo de los valores de referencia para la concentración de
eritrocitos fue de 6.9 a 11.4 cel x 106/mm3, el cual es mayor a los valores que propusieron
Filho et al. (1992) para la misma especie (3.966 ± 0.17 106 cel/mm3).Una disminución
significativa en el recuento de glóbulos rojos se observó posterior al consumo de la dosis alta (4%) de ajo con 8.50 ± 0.76 cel x 106/mm3, en contraste el grupo control registró 9.86
± 0.77 106 cel x 106/mm3. Este resultado difiere de lo observado en O. niloticus alimentado
por 90 días con un suplemento del 2 y 4% de polvo de ajo en la dieta, en el cual se registró un incremento en la cantidad de eritrocitos del 12.7 y 23.6%, respectivamente (Shalaby
et al., 2006), asimismo en tilapias alimentadas durante 60 días con polvo de ajo al 1%, se registró un incremento de casi el 100% (Mehrim et al., 2014). Esta tendencia también fue documentada en O. mossambicus que recibió alimento suplementado con el 2 y 3% de polvo de ajo durante 60 días, donde el incremento fue del 53 y 66%, respectivamente (Felicitta et al., 2013).
La disminución de la concentración de eritrocitos, también se presentó después de la infestación parasitaria en el grupo dosis alta (7.06 ± 1.08 cel x 106/mm3) con respecto al
control (10.95 ± 1.18 cel x 106/mm3), que al parecer se vio más afectado por la pérdida
de sangre debido al hábito alimenticio de Z. seriolae, situación que también fue documentada en S. dumerili (Montero et al., 2004). Estos resultados difieren de lo observado en O. mykiss alimentado con polvo de ajo a razón de 1 g/100 g (Nya y Austin, 2009) y cuando se suministró 1 ml de alicina pura por 100 g de alimento (Nya et al., 2010) durante 14 días para posteriormente infectarlos con A. hydrophila, bajo esta condición fue notable un incremento de 11 veces y 8% la concentración de eritrocitos, respectivamente. Resultados similares se han documentado en L. calcarifer al consumir de 5 a 20 g/kg de polvo de ajo durante dos semanas y posteriormente ser infectado con
V. harveyi, donde el incremento en la concentración de eritrocitos fue de 32 a 152% en la concentración de eritrocitos (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). Además del polvo de ajo y la alicina pura, otros compuestos derivados del ajo también han sido evaluados con el mismo propósito, tal es el caso del disulfuro de alilo (1 a 2 g/kg) que fue agregado en el alimento y proporcionado durante 45 días a P. mesopotamicus e infestado naturalmente con Anacanthorus penilabiatus; en estos peces se observó un incremento del 35% en la concentración de eritrocitos (Martins et al., 2002).
En otros vertebrados como caninos, bovinos y equinos se ha reportado anemia hemolítica causada por el consumo de ajo, debido al daño oxidativo de los eritrocitos (Rae, 1999; Pearson et al., 2005; Yamato et al., 2005; Weiss y Wardrop, 2011), en peces este efecto no ha sido documentado, por lo que la disminución en la concentración de eritrocitos posterior a la adición de ajo en el alimento, parece estar relacionada probablemente con varias causas: la duración de la administración del polvo de ajo por 30 días y/o a la dosis real ingerida por los organismos relacionada con la pérdida de alicina en el agua.
En el jurel S. lalandi, el intervalo de referencia del hematocrito fue de 48.6 a 66.4%, el cual se mantuvo en el rango normal de 50.1 ± 12.4 propuestos por Filho et al. (1992) para la misma especie. En el presente trabajo, el hematocrito disminuyó después de 32 días de que los peces consumieron el alimento enriquecido con el 4% de polvo de ajo (53.10 ± 3.49%) con respecto al valor del grupo control (57.69 ± 8.58%), sin embargo, posterior a la infestación experimental, el hematocrito en el grupo dosis baja disminuyó poco menos de 10% (47.69 ± 5.45%) en comparación con el grupo dosis alta que fue de 1.3% (51.72 ± 5.72%).
En O. niloticus se observó un efecto parecido al registrado en este experimento por la adición de ajo, cuando se suministró una dieta suplementada con polvo de ajo al 1 y 2% por 90 días, con una disminución del 16% en el valor del hematocrito (Shalaby et al., 2006). Por el contrario, en O. niloticus alimentadas durante 60 días con una dieta enriquecida con el 1% de polvo de ajo, el incremento fue del 55% (Mehrim et al., 2014). En la tilapia O. mossambicus, se observó un incremento del 50% cuando se alimentó durante 60 días con una dieta que contenía el 3% de polvo de ajo (Felicitta et al., 2013). En otras especies como O. mykiss que recibió alimento con polvo de ajo a razón de 0.05 a 1 g/100 g de la dieta, el incremento fue de 29% a 6%, respectivamente (Nya y Austin, 2009).
El hematocrito también se ha evaluado considerando la dieta con ajo o alguno de sus compuestos y la presencia de parásitos, tal es el caso de P. mesopotamicus infestado naturalmente con A. penilabiatus y alimentado durante 45 días con disulfuro de alilo a razón de 1 a 2 g/kg de la dieta (Martins et al., 2002). Los autores mencionan que no
encontraron diferencias entre las dosis, sin embargo, hubo un incremento en el hematocrito a medida que aumentó la duración del tratamiento con este fitobiótico de 15 a 45 días.En el presente estudio con el jurel, el hematocrito disminuyó 8% después de consumir alimento con ajo y 10% posterior a la infestación parasitaria, por lo que al parecer el ajo tuvo un efecto en mantener estos valores en el intervalo de referencia.