Los jureles fueron donados por la empresa Ocean Baja Labs S. de R.L. de C.V. ubicada en el ejido de Eréndira, Municipio de Ensenada, Baja California, México. Los organismos tenían un peso promedio de 4.24 ± 1.16 g y se mantuvieron en un estanque de 3 m3 en
el Laboratorio de Peces Marinos del Departamento de Acuicultura de CICESE, hasta que alcanzaron 93.5 ± 2.98 g en 68 días para transferirlos al sistema experimental.
Para monitorear la calidad del agua del cultivo cada día se midieron las siguientes variables: el pH con un potenciómetro Thermo modelo Orion 290ª+, el oxígeno disuelto (mg/l), saturación de oxígeno (%), salinidad (ups) y temperatura (°C) con un analizador multiparámetrico YSI modelo 85. La concentración de amonio, nitritos y nitratos se cuantificó, dos veces por semana con los reactivos de la línea Permachem Reagents de HACH®.
Los peces se trasladaron al laboratorio húmedo del Departamento de Acuicultura y se colocaron en 9 tanques de 460 litros de capacidad. Cada tanque estaba provisto de aireación y un calentador de titanio acoplado a una caja reguladora de la temperatura y un sensor de nivel. Se colocaron 20 organismos en cada uno de los tanques que estaban distribuidos en tres grupos experimentales, un grupo control y dos tratamientos con 2 y 4% de polvo de ajo, cada uno con tres repeticiones (n=180 organismos). Durante 15 días se realizó la aclimatación de los peces a las nuevas unidades de cultivo, el agua se mantuvo a 20 °C y 12 recambios al día; los organismos fueron alimentados con Marine MX de Skretting®, con una ración diaria equivalente al 3.5% de la biomasa suministrada en dos raciones.
Posteriormente se realizó el incremento de 1 °C cada dos días, para llevar la temperatura de 20 a 25 °C, ya que Rodríguez Fonseca (2014) reportó que el intervalo térmico de 22 a 25 °C es el adecuado para el cultivo de S. lalandi; la cual se mantuvo durante la fase experimental. El régimen de alimentación y recambios de agua se mantuvo durante 10 días más, de manera que las condiciones fisiológicas del organismo se estabilizaran.
5.2 Diseño experimental
El experimento se diseñó para 20 organismos por tanque (n=180), en un total de 9 unidades de cultivo, en donde se mantuvieron hasta el día 32 con el agua a 25 °C, 33 ups, 12 recambios al día y alimentándose con las dietas experimentales. A la dieta comercial se le adicionó polvo de ajo al 2 y 4% para los grupos dosis baja y alta, respectivamente; mientras que al grupo control solamente se le agregó aceite de pescado. El día 33 se introdujeron 2 peces infestados con Zeuxapta seriolae por unidad de cultivo, se alteraron las condiciones del ambiente al aumentar la temperatura del agua a 28 °C y disminuir los recambios, a 3 por día, de manera que aumentara la turbiedad y la concentración de desechos nitrogenados. La ración de alimento suplementado con polvo de ajo se mantuvo igual hasta el día 61. Los muestreos se realizaron a los 0, 32 y 61 días de experimento, en cada muestreo se extrajeron 4 organismos por tanque y se evaluó el peso, la longitud, el índice de condición de Fulton, el factor de conversión alimenticia, la prevalencia e intensidad parasitaria, el recuento total de eritrocitos y leucocitos, el conteo diferencial de leucocitos, las proteínas totales, la albúmina y las globulinas.
5.3 Preparación del polvo de ajo
Al ajo adquirido en un supermercado de la localidad, se le eliminó la cutícula delicadamente y se cortó en láminas de aproximadamente 1 mm de espesor con la ayuda de un bisturí, las cuales se colocaron en una charola metálica cubierta con papel encerado y se secaron en una estufa marca Thermolyne modelo Oven series 9000 a 60 °C durante 20 horas.
El ajo seco se introdujo en una licuadora marca Osterizerpara triturarlo hasta obtener un polvo fino, que se filtró a través de un tamiz #35 para eliminar partículas mayores a 500 µm y el producto resultante se almacenó en un recipiente de vidrio color ámbar a temperatura ambiente.
5.4 Preparación del extracto de ajo
El extracto acuoso de ajo se preparó siguiendo la metodología de Militz et al. (2013). Se homogenizó con agua a razón de 1 g de ajo fresco sin cutícula por cada 5 ml de agua destilada durante 60 s. El homogenizado se dejó reposar por 5 minutos y se filtró a través de una malla de 105 µm y posteriormente por un filtro Whatman #1. El producto final se almacenó en refrigeración en un recipiente de vidrio cerrado y cubierto con papel aluminio.
5.5 Cuantificación de la alicina del polvo y el extracto de ajo
Con el propósito de conocer la concentración de uno de los principios activos en mayor proporción en el ajo y al que se le atribuyen la mayor cantidad de efectos benéficos, se realizó la cuantificación de alicina. Esta valoración se realizó en el Laboratorio de Revaloración de Residuos del CINVESTAV- Unidad Saltillo. Para conocer la concentración de alicina presente en el polvo y el extracto de ajo, primero se mezclaron 5 ml de extracto de ajo o 3 g del polvo de ajo con 30 g de solución de etilparabeno y se homogenizaron durante 2.5 minutos en un agitador Thermo® Vortex Maxi Mix I, para posteriormente dejarlo reposar durante 30 min. El homogenizado se centrifugó a 3500 rpm (5257.5 X·g) durante 10 min en un equipo Solbat C-600A y se tomaron 2 ml del sobrenadante que se aforó a 10 ml con ácido cítrico 1 mM. Finalmente, con la ayuda de un filtro de 0.45 µm se inyectó en viales que se colocaron en el equipo de HPLC Agilent Technologies 1200 series, con columna Phenomenex Luna 5µ C18(2) 100 A. Se utilizó una solución de 55% agua: 45% metanol como fase móvil con un flujo de 0.8 ml/min. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 µl, se apagó la iluminación del equipo y se mantuvo una temperatura de 25 °C. Finalmente, se leyó la absorbancia a 230 nm (Anexos).
5.6 Cuantificación de alicina lixiviada del alimento para peces
mezclado con polvo de ajo
Se colocaron 10 g de alimento mezclado con polvo de ajo (2 y 4%) y 2% de aceite vegetal en un recipiente con 10 ml de agua a 35 ups y 25ºC por 30 segundos, 1, 4.5 y 13.5 min. Posteriormente, se mezclaron 3 ml del agua de mar con 5 g de etilparabeno y se homogenizaron en un agitador vortex por 1 minuto (Figura 8). Finalmente, se utilizó un filtro de 0.45 μm para depositar la muestra en los viales para el análisis por HPLC.
Figura 8. a) Alimento con polvo de ajo en agua de mar, b) Agua de mar después del tiempo de lixiviación, c) Lixiviado mezclado con el estándar interno.
5.7 Preparación de la dieta y estrategia de alimentación
La dieta base utilizada para el grupo control y los dos grupos experimentales fue Marine MX de Skretting®, de 4 mm de diámetro de partícula y compuesto con 46% de proteína cruda, 12% de grasa cruda y 1% de fibra cruda. El alimento para el grupo control se mezcló con el aceite de pescado al 3% de la dieta base, mientras que para preparar la dieta de los grupos experimentales (dosis baja y dosis alta) se mezcló el aceite de pescado al 3% de la dieta base con el 2 y el 4% de polvo de ajo respectivamente. El aceite de pescado se utilizó para que el polvo de ajo se pudiese adherir a la superficie de las partículas de alimento. Se prepararon lotes de 1 kg de alimento para cada uno de los grupos (Figura 9).
Figura 9 . Preparación de la dieta con ajo: (a) Homogenización de polvo de ajo y aceite, (b) Mezcla de homogenizado con el alimento, (c) Alimento mezclado con polvo de ajo.
Al inicio del experimento los organismos consumieron una ración equivalente al 3.5% de su biomasa y posteriormente, a la mitad del experimento, la ración se ajustó al 2.5%, tomando como guía la tabla de alimentación propuesta por Orellana et al. (2014).
5.8 Infestación experimental
Con la intención de contar con un vector para la transmisión de Zeuxapta seriolae, un grupo adicional de jureles infectados con Z. seriolae (vectores) se mantuvo durante un mes en un tanque de 7 m3 equipado con su propio biofiltro. Durante este período los
peces se alimentaron con Marine MX de Skretting® de 4 mm.
La infestación de los organismos experimentales se hizo por cohabitación, al finalizar los 32 días de alimentación con la dieta experimental (grupo control con dieta base y grupos experimentales con adición de polvo de ajo), se colocaron dos peces vectores en cada tanque de cultivo. Para identificar a los jureles que sirvieron como vectores, antes de introducirlos en los tanques se les implantó una marca electrónica (Biomark® modelo KAA000870) en la musculatura dorsal del flanco izquierdo (Figura 10). Para comprobar la ubicación de la marca electrónica se utilizó un lector portátil (Mini Portable Reader Destron Fearing modelo 800-0249-01).
Figura 10. Implantación de marca electrónica en peces parasitados.
Con la intención de hacer más propicio el ambiente para el parásito y aumentar las posibilidades de éxito de infestación, a partir de la fecha en que se introdujeron los jureles vectores en los tanques (día 33), se elevó la temperatura de 25 a 28 °C y se disminuyeron los recambios de agua a 3 por día, lo que propició el incremento de la concentración de los compuestos nitrogenados y la turbiedad del agua.
5.9 Prevalencia e intensidad parasitaria
Para evaluar la intensidad media y prevalencia de la infestación parasitaria al final del experimento, a cada pez se le disecaron las branquias y se preservaron en una solución de alcohol (60%). Posteriormente, en las branquias de cada pez se contó la cantidad de parásitos (Z. seriolae) con la ayuda de un microscopio estereoscópico modelo Discovery.V8 (Zeiss®) (Figura 11).
Para el cálculo de la prevalencia parasitaria se utilizaron las siguientes ecuaciones (Bush et al., 1997): 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟á𝑠𝑖𝑡𝑜𝑠 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑠𝑝𝑒𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑥𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠 (1) 𝑃𝑟𝑒𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑠𝑝𝑒𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑠𝑝𝑒𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑒𝑥𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠∗ 100 (2)
5.10 Índices biológicos
5.10.1 Índice de condición de Fulton
El índice de condición se calculó los días 0, 32 y 61 del experimento, utilizando las medidas del peso húmedo (g) y la longitud (cm) de 4 organismos de cada unidad de cultivo. Para el cálculo de este índice se utilizó la siguiente ecuación (Ricker, 1975)
3 100 L W K (3) Donde:
K= Índice de condición de Fulton W= Peso húmedo (g)
L= Longitud (cm)
5.10.2 Índice hepatosomático
El índice hepatosomático (IHS) se calculó los días 0, 32 y 61 del experimento. Para realizar este cálculo se midió el peso total húmedo (g) y el peso húmedo del hígado (g) de 4 organismos de cada unidad de cultivo y se utilizó la siguiente ecuación (Sadekarpawar y Parikh, 2013):
T H P P IHS100 (4) Donde:
IHS= Índice hepatosomático PH= Peso hígado (g)
PT= Peso total (g)
5.11 Consumo de alimento y Factor de conversión alimenticia
El consumo de alimento de los peces se calculó a los 32 y 61 días del experimento, mediante la siguiente ecuación:
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑔/𝑝𝑒𝑧) =𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑔)
𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑒𝑐𝑒𝑠
(5)
El factor de conversión alimenticia (FCA) se calculó los días 32 y 61 del experimento. Para realizar este cálculo se midió el peso húmedo total (g) de los peces de cada unidad experimental (biomasa total) y se relacionó con la cantidad de alimento consumido en cada periodo, mediante la siguiente ecuación:
𝐹𝐶𝐴 =𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑜𝑑𝑜 (𝑔)
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑔𝑎𝑛𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑜𝑑𝑜 (𝑔) (6)
5.12 Análisis de muestras de sangre
La sangre de los peces se obtuvo mediante la punción de la vena caudal con una jeringa Terumo® de 3 ml provista de una aguja calibre 21. Posteriormente se colocó una parte de la sangre extraída en un tubo de 0.5 ml con el anticoagulante K2EDTA (BD
Microtainer®) y otra porción de sangre se depositó en un tubo Eppendorf® de 1 ml sin anticoagulante.
Los tubos con EDTA que contenían la muestra se mantuvieron a 8 °C en un refrigerador VWR Scientific® hasta que fueron utilizados para realizar los frotis sanguíneos, el hematocrito y el recuento de eritrocitos y leucocitos.
Para obtener las muestras de suero, después de la extracción, la sangre se colocó en tubos Eppendorf® y permanecieron en refrigeración por una hora, permitiendo así la formación del coágulo (Stockham y Scott, 2013). Posteriormente se centrifugaron por 10 minutos a 7,000 RPM (5040 X·g) en una centrífuga VWR® Micro 1207, el suero se mantuvo -81 °C en un ultracongelador Revco ExF de la marca Thermo Scientific®, hasta que se realizaron los análisis de la concentración de proteínas totales y albúmina.
5.12.1 Hematocrito
Los tubos capilares de microhematocrito (Corning®) se llenaron con sangre con anticoagulante a ¾ partes de su capacidad y se sellaron con plastilina en uno de sus extremos. Se colocaron en una centrífuga de microhematocrito Clay Adams® por 10 minutos a 7,000 RPM (5117.1 X·g). Finalmente los capilares se colocaron en un lector de microhematocrito Clay Adams® para medir la proporción de suero y del paquete celular, los resultados se expresaron como porcentaje (%) del volumen total.
5.12.2 Recuento de eritrocitos y leucocitos
La sangre con anticoagulante se mezcló con la solución de Natt-Herrick en una proporción 1:200 (Natt y Herrick, 1952) y se dejó reposar por una hora como mínimo, tiempo necesario para teñir las células sanguíneas del jurel. A continuación, la muestra se depositó en cada cámara de un hematocitómetro (Hausser Scientific®) y se dejó reposar por 10 minutos.
Para el recuento total de eritrocitos y leucocitos se utilizó un microscopio Axio Scope.A1 (Zeiss®) con un aumento de 400X. En cada cámara del hematocitómetro se ubicaron los cuadrantes correspondientes para el conteo de los leucocitos y eritrocitos (Figura 12). El número de leucocitos y eritrocitos (por sus siglas en inglés WBC y RBC, respectivamente) fueron calculados con las siguientes ecuaciones:
𝑊𝐵𝐶 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑢𝑐𝑜𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠
8 𝑥 200 (7)
𝑅𝐵𝐶 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑒𝑟𝑖𝑡𝑟𝑜𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠 𝑥 1
0.020 𝑚𝑚3 𝑥 200 (8)
Figura 12. Cámara del hematocitómetro: cuadrantes para el recuento de leucocitos (azul) y eritrocitos (rojo).
5.12.3 Análisis diferencial de leucocitos
El frotis sanguíneo se hizo colocando 3 µl de sangre con anticoagulante en uno de los extremos de un portaobjetos de vidrio (Corning®) y extendiendo la muestra con la ayuda del borde de otro portaobjetos. El frotis se secó a temperatura ambiente, para luego sumergirlo en la solución fijadora del kit Hemacolor® y a continuación se secó bajo las condiciones ambientales del laboratorio. El frotis se sumergió en la solución 2 y 3 del kit Hemacolor® por 1 minuto respectivamente y se lavó con agua destilada hasta retirar completamente los restos de colorante. Finalmente se colocó resina Cytoseal®60 y un cubreobjetos de 24 x 50 mm (Corning®) para sellar y conservar la muestra.
Los frotis sanguíneos se observaron en un microscopio Axio Scope.A1 (Zeiss®) con un aumento de 630X y se clasificaron y cuantificaron los diferentes tipos de leucocitos: neutrófilos, monocitos, eosinófilos, basófilos y trombocitos.
5.12.4 Bioquímica sérica
El suero previamente ultracongelado (-80 °C) se descongeló en un refrigerador (VWR Scientific®) a 4 °C durante una noche y posteriormente se analizaron las concentraciones de proteínas totales y albúmina.
5.12.4.1 Proteínas totales
El análisis de la concentración de proteínas totales se realizó por la técnica de Bradford, estandarizada para microplaca por Castillo y Hernández (2013, en proceso). Para preparar la curva de calibración se depositaron alícuotas de 5, 10, 15, 20 y 25 µl del estándar de calibración de proteínas de 0.5 mg/ml en tubos eppendorf y se aforaron a 100 µl. Posteriormente se hicieron las diluciones de las muestras de suero, mezclando 10 µl con 500 µl de agua destilada. En una microplaca de 96 pocillos (Costar Corning®), se colocaron por triplicado 10 µl de agua destilada (blanco), 10 µl de cada una de las soluciones de calibración y de las muestras de suero; a cada pocillo se le agregaron 100 µl de solución de Bradford (Amresco®).
En un espectrofotómetro Varioskan Flash (Thermo®) se programó el protocolo Bradford para proteínas totales, que incluyó: agitación por 40 s, incubación a 25 °C por 5 min, registro de las absorbancias a una longitud de onda de 595 nm y sustracción de la absorbancia del blanco. Para obtener la concentración de proteínas totales (mg/ml) de cada muestra, se utilizó la ecuación de la regresión lineal de la curva de calibración con un coeficiente de determinación mayor a 0.95.
5.12.4.2 Albúmina
La concentración de albúmina se obtuvo mediante espectrofotometría con el kit de albumina AB362 de Randox®. Para el blanco se colocaron 10 µl de agua destilada y 3 ml de reactivo de verde de bromocresol (R1) en cubetas de 5 ml. Para el estándar se colocaron 10 µl de solución de calibración y 3 ml de R1 y en las muestras se colocaron 10 µl de suero con 3 ml de R1. La reacción se incubó a una temperatura entre 20 a 25 °C durante 5 minutos, a continuación se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm en un espectrofotómetro DR5000 (HACH®).
Las absorbancias finales se obtuvieron por la diferencia de la absorbancia de la muestra y el blanco. Estos datos fueron introducidos a la ecuación que provee el fabricante del kit de albúmina:
[𝑎𝑙𝑏ú𝑚𝑖𝑛𝑎](𝑔⁄ ) =𝑙 𝐴𝜆 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝜆 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑥 [𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟] (9)
5.12.4.3 Globulinas
La concentración de globulinas se calculó por la diferencia entre proteínas totales y albúmina (Crivelenti et al., 2011) .
5.13 Análisis estadístico
Se realizaron las pruebas de Shapiro-Wilks, Kolmogorov-Smirnov y Liliefors para la normalidad y las pruebas C de Cochran, Hartley y Bartlett para la homogeneidad de varianza, donde se demostró que los valores no cumplieron con la normalidad ni homogeneidad de varianza, por lo que se realizaron pruebas no parámetricas . Además se realizó el análisis de varianza de una vía para comprobar que las unidades correspondientes a cada tratamiento fueran realmente réplicas, las unidades que se comprobaron que no funcionaban como réplicas no fueron tomadas en cuenta para el
análisis estadístico. El análisis de la concentración de alicina en el extracto y el polvo de ajo se realizó por medio de una prueba de Friedman. Para el análisis de los tratamientos de las variables productivas, de hematología y química sanguínea se realizó la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de Wilcoxon para el análisis de los días de muestreo de cada tratamiento. En caso de haber diferencias significativas se realizó la prueba de comparación múltiple de rango de medias de todos los grupos. Todas las pruebas fueron realizadas en el programa estadístico Statistica 10 y para considerar las diferencias se utilizó un nivel de significancia de ɑ=0.05.