1. OBJETIVO
Probará el efecto de diferentes agentes físicos y agentes químicos a diferentes grupos microbianos, evaluará el efecto de los agentes sobre el crecimiento microbiano.
2. INTRODUCCION
Los microorganismos, como todos los seres vivos, requieren unas condiciones ambientales específicas para su desarrollo. Esto significa que existen numerosos parámetros y sustancias que influyen en su crecimiento.
La resistencia bacteriana se define como "una condición microbiológica caracterizada por la capacidad natural o adquirida, por parte de una cepa bacteriana de permanecer refractaria a los efectos bactericidas o bacteriostáticos de un antibiótico". La resistencia bacteriana obliga al desarrollo y utilización de nuevos antibacterianos, que son más costosos y a veces más tóxicos que los empleados habitualmente. Cuando se lanza al mercado un fármaco antibacteriano, se define el espectro de microorganismos sobre los cuales es eficaz, pero luego este patrón va cambiando a medida que la droga se utiliza clínicamente, llegando en algunos casos a caer en el desuso.
Factores Físicos
En lo que se refiere a los agentes físicos, son numerosos los factores que influyen en el crecimiento microbiano, si bien no todos ellos son susceptibles de ser empleados para ejercer control. Entre los principales factores físicos y físico-químicos que influyen decisivamente sobre el crecimiento de los microorganismos, cabe destacar: Temperatura
Energía sonora pH Radiaciones Actividad de agua Oxígeno Tensión superficial.
Todos estos factores son importantes, pero a nivel práctico, los más empleados son la temperatura, el pH, la actividad de agua y la concentración de oxígeno. La actuación sobre estos factores es una práctica habitual para el control del crecimiento microbiano. Se emplean temperaturas elevadas con fines de esterilización de materiales, o temperaturas bajas, con la finalidad de conservación. El pH se establece en valores del rango ácido en alimentos fermentados como el yogur o lo encurtidos. La desecación (disminución de la actividad de agua) es otra de las técnicas habitualmente empleadas en la industria alimentaria para el control del crecimiento microbiano. Por último, la modificación de las concentraciones de oxígeno, en alimentos envasados a vacío o productos envasados en atmósferas inertes, es también una práctica extendida a nivel industrial.
Entre todos estos factores, sin duda alguna, la temperatura es el agente físico que ha recibido una mayor atención por parte de los investigadores, ya que su efecto sobre el crecimiento microbiano es extraordinario.
La mayoría de las bacterias, especialmente las especies patógenas para el hombre, tienen un intervalo de crecimiento comprendido entre 20°C y 45°C, con un óptimo de temperatura a 35-37°C (bacterias mesófilas). Pero hay otras, que pueden o incluso necesitan desarrollarse a otras temperaturas (Psicrotróficas: 4-20 ºC, Termofílicas: 65°C).
De especial interés en cuanto a su resistencia térmica son las bacterias esporuladas, ya que las esporas pueden resistir temperaturas cercanas a los 80°C durante periodos de tiempo que resultan mortales para el resto de las bacterias.
Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes: bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano;bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias.
En general, si no sólo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro microbicida depende muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo durante el que actúa. Por lo que respecta a sustancias químicas, desde el comienzo de la Microbiología se han buscado compuestos que limitaran e inhibieran el desarrollo de los microorganismos. Así nació la denominada “Era Antibiótica” desde mediados del siglo XX, que ha ido evolucionando desde los antibióticos clásicos hasta los modernos compuestos de origen sintético (quimioterapéuticos).
Existen algunas pruebas que sirven para poner de manifiesto la capacidad antimicrobiana de los diferentes quimioterapéuticos y antibióticos. Entre estas pruebas, se pueden destacar la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la realización de Antibiogramas.
La determinación de la CMI se realiza a partir de medios líquidos inoculados con la misma cantidad de cultivo microbiano y a los que se añaden cantidades crecientes del antimicrobiano objeto de estudio. La mínima concentración en la cual no aparezca enturbiamiento será considerada como la CMI de ese quimioterapéutico. El antibiograma, realizado en medios sólidos, se lleva a cabo por el método de difusión en placa. El organismo se siembra mediante esta técnica y se le expone a la acción de varios discos de papel impregnados antimicrobianos, que en función de su actividades frente al microorganismo darán lugar o no a un halo de inhibición a su alrededor. En caso de que se forme dicho halo, el diámetro de éste clasificará la bacteria como sensible, moderadamente sensible, intermedio o resistente.
3. CORRELACION CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA (ING. BIOQUIMICA BQO-0525)
Tema. Crecimiento y propagación de los microorganismos.
Subtema. Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento microbiano. Los agentes físicos y químicos y su influencia en el control de los microorganismos.
4. MATERIAL Y EQUIPO
Para cada tratamiento térmico.
Descripción del material Cantidad Equipo
Agar nutritivo (g/l) 23 Autoclave
Caldo nutritivo (g/l) 8 Baño metabólico (3)
Etanol (ml) 10 Horno
Cloro comercial (ml) 10 Microscopio
Microdin (ml) 10 Cámara de Neubauer
Amoxicilina unidad Estufa incubadora
Tetraciclina unidad
l-quine unidad
Tubos tapón con rosca de 18 x 150 40
Cajas Petri 20
Pipeta de 10 ml 5
Pipeta de 1 ml 15
5. METODOLOGIA Preparación
1. Preparar 10 ml de una solución de 10 % de cloro comercial en tubo con tapón de rosca.
2. Prepara 10 ml de una solución de 5 % de microdin (plata coloidal) comercial en tubo con tapón de rosca.
3. Preparar 10 ml de una solución de etanol al 70 % en tubo con tapón de rosca. 4. Preparar una solución de NaOH 0.1 N, envasarlo en un frasco.
5. Preparar una solución de HCl 1 N, envasarlo en un frasco.
6. Esterilizar 10 tubos con 5 ml de agua destilada y conservar en refrigeración hasta su uso.
7. Esterilizar 5 tubos con 9 ml de solución salina y conservar en refrigeración hasta su uso.
8. Esterilizar 2 tubos con 9 ml de caldo nutritivo a pH de 5.0, 7.0 y 9.0 (ajustar con las soluciones ácida y base previamente elaborada) y conservar en refrigeración hasta su uso.
9. Esterilizar 10 tubos con 9 ml de caldo nutritivo y conservar en refrigeración hasta su uso.
10. Esterilizar 1 matraz Erlenmeyer con 99 ml de solución salina y conservar en refrigeración hasta su uso.
Procedimiento
1. Inocular la cepa bacteriana en una caja Petri con agar nutritivo e incubar durante 24 horas.
2. Suspender las células crecidas en un tubo con caldo nutritivo e incubarlo durante 8 horas.
3. Tomar una alícuota de 1 ml de las células suspendidas en el caldo nutritivo y transferirlo a matraz de 99 ml de solución salina estéril.
Determinación del efecto del pH
1. Tomar los tubos con caldo nutritivo estéril a pH de 5.0, 7.0 y 9.0 e inocularlos con 1 ml de suspensión celular (en solución salina) cada uno.
2. Incubarlos en baño metabólico a 35°C, durante 24 horas y contar las concentración celular usando la cámara de Neubauer.
Determinación del efecto de la Temperatura
1. Tomar 3 tubos con caldo nutritivo estéril e inocularlos con 1 ml de suspensión celular (en solución salina) cada uno.
2. Incubarlos en baño metabólico a 20°C, 30°C y 40°C respectivamente, durante 24 horas y contar la concentración celular usando la cámara de Neubauer.
Determinación del efecto de agentes químicos
1. Tomar 3 tubos con caldo nutritivo estéril e inocularlos con 1 ml de suspensión celular (en solución salina) cada uno, adicionar 1 ml de los 3 diferentes químicos (Etanol, Cloro comercial y microdin) respectivamente, exponiéndolos al químico durante 15 minutos.
2. Tomar 0.5 ml del caldo de cada uno de los tratamientos y utilizarlo para inocular una caja Petri con agar nutritivo, hacerlo por duplicado, respectivamente.
3. Incubarlas en la estufa de incubación a 35°C, durante 24 horas y contar la concentración celular usando cuenta viable.
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
1. Previamente se preparan 5 tubos de ensayo con 1 ml de Caldo Nutritivo y un tubo de ensayo con 1,8 ml. A este último se añaden 0,2 ml de solución madre de antimicrobiano (dilución 1:10).
2. Tras homogeneizar, se toma 1 ml y se transfiere a uno de los tubos con 1 ml; el proceso se repite (diluciones seriadas) con todos los tubos para ir obteniendo concentraciones de antimicrobiano mitad de la anterior (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160).
3. Cada tubo se inocula con 1 ml de un cultivo bacteriano de 8 horas llevado a dilución 1:100, de solución salina estéril; se emplea para inocular cada uno de los tubos con las diferentes concentraciones del antimicrobiano.
4. Los tubos se incuban a 37°C durante 24 horas. Se tomará como CMI la del tubo de menor concentración en el que no se obtenga crecimiento (turbidez).
Antibiograma
2. Se introduce en el medio un hisopo, eliminando el exceso de líquido presionando sobre las paredes del tubo antes de sacarlo de éste.
3. Con el hisopo se siembran placas de Agar Nutritivo por descarga masiva sobre la superficie del medio.
4. Se dejan secar las placas durante cinco minutos y se colocan los discos impregnados en antibióticos mediante el uso de pinzas estériles.
5. Para colocar los discos hay que dejar unos 20 mm entre disco y disco, y unos 15 mm con respecto a los bordes de la placa.
6. Transcurridos 15 minutos (durante los cuales se produce la difusión de los antibióticos), se incuba a 37 ºC durante 18-24 horas.
7. Transcurrido el tiempo de incubación, se miden los halos de inhibición alrededor de cada disco.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS
1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto agentes físicos y químicos sobre los microorganismos.
7. REPORTE DEL ALUMNO
1. Describa a través de una tabla los resultados: Tratamiento °C Concentración celular (Células/ml) Observaciones 20 1289 30 44567 40 etc
2. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen.
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A.