1. OBJETIVO
Aplicará las técnicas y medios de cultivo para la identificación a través de pruebas bioquímicas del grupo de enterobacterias.
2. INTRODUCCION
Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene más
de 40 géneros, más de 150 especies y 20 especies con patología humana. Pueden tener morfología de bacilos o cocos. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies animales, aerobios o anaerobios facultativos
En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no cumplen todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia:
1. Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos.
2. No son exigentes, son de fácil cultivo.
3. Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir,
carecen de la enzima citocromo oxidasa, catalasa positiva
4. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. 5. Son anaeróbicos facultativos.
6. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas.
Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa, aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22ºC y 37ºC.
En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en grandes números en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de la fermentación. En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos, desnutrición, etc.
La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y determina la aparición de infecciones, cuya gravedad depende del punto de entrada. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies provocan patologías específicas:
La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea.
La especie Shigella dystenteriae es el agente responsable de la disentería bacilar. La especie Escherichia coli enterotóxica es responsable de la gastroenteritis infantil.
La especie Yersinia pestis es responsable de la peste.
La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como resultado de tratamiento en un hospital.
Para la identificación completa es necesaria la realización de las pruebas bioquímicas las cuales muestran las diferencias en sus rutas metabólicas de cada especie como parte de la expresión de su información genética.
El aislamiento de este grupo se realiza con pruebas presuntivas y su posterior prueba confirmativa, utilizando medios selectivos diferenciales, seguido de pruebas bioquímicas y por último el uso de pruebas serológicas.
Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos, como la fermentación de los diferentes azúcares, la producción o no de azufre, la presencia de enzimas metabólicas (β-galactosidasa, desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia de antígenos en su constitución celular, tales como en el lipopolisacárido (antígeno O), el antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K), etc.
3. CORRELACION CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA (ING.
BIOQUIMICA BQO-0525)
Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas.
Subtema. Criterios de clasificación en la identificación de microorganismos.
La identificación de las Enterobacteriaceae se realiza a través de incubar a los presuntos microorganismo con medios de cultivo selectivos y diferencias y posterior incubación con sustratos específicos para determinar su asimilación y fermentación de los mismos, para la identificación de sus rutas metabólicas, como su expresión de su información genética.
4. MATERIAL Y EQUIPO
Descripción del material Cantidad Equipo
Caldo lactosado (g/l) 12 Autoclave
Agar XLD (g/l) 55 Mechero Fisher
Caldo base fermentación (g/l) 15 Campana de flujo laminar Glucosa (g/l) 7 Unidad filtración millipore
Lactosa (g/l) 7
Agar hierro de Kliger (KIA) (g/l) 52.5
Medio de SIM (g/l) 30
Medio de Citrato de Simmons (g/l) 23
Medio TSI (g/l) 63.5
Agar manitol (g/l) 35
KNO3 (g/l) 1
Cajas petri 20
Tubos 18 x 150 mm c/tapón de rosca 30
Probeta de 100 ml 1
Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml 1
gradilla 3
Asa de platino 1
Asa varilla de vidrio 1
Tubitos Durham 40
Tubos 16 x 150 mm c/tapón de rosca 80
5. METODOLOGIA Preparación del material
1. Esterilizar solución de trabajo en 5 tubos de 18 X 150 conteniendo cada uno 9 ml, para disolver la muestra en diluciones decimales conocidas.
2. Esterilizar 15 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo lactosado. (Prueba presuntiva)
3. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo verde bilis verde brillante. (Prueba confirmativa).
4. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo base para fermentación
5. Esterilizar solución de azucares (glucosa y lactosa) utilizando el filtro millipore. 6. Añadir 1 ml de solución estéril de los azucares en tubos con caldo base por
separado, al momento de aplicar la prueba.
7. Esterilizar los medios agar MAcConkey y XLD y transferir a 5 cajas petri por cada medio. (seguir indicaciones de etiqueta).
8. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar manitol (con nitrato de potasio) y SIM. Solidificar el agar en forma vertical. (agar semisólido).
9. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar hierro de Kliger, citrato de Simmons, TSI. Solidificar los medios inclinándolos hasta que el medio este entre 2 y 3 cm de la boca del tubo.
Aislar
1. Tomar 1 gramo (o 1ml de muestra) previamente homogenizada y cuarteada y transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilución hasta terminar la serie.
2. Inocular por triplicado, transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las dilución a tubos con caldo lactosado, incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (prueba presuntiva)
3. Inocular cada 1 ml del caldo incubado que resulto positivo (producción de gas en el tubito de Durham) en tubo con medio de caldo verde bilis brillante, incubar a
4. Inocular por duplicado, transfiriendo 1ml de la muestra de las primeras 3 diluciones por separado en cajas petri con agar MacConkey. Sembrar por estría e incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfología colonial).
Purificar
1. Inocular el agar XLD con los tubos positivos de la prueba confirmativa. Sembrar por estría. Incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfología colonial).
2. Inocular el agar XLD con las colonias con características de enterobacterias de las cajas incubadas de agar MacConkey. Sembrar por estría. Incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfología colonial).
Identificar
1. Inocular al menos tres colonias con características típicas de enterobacterias en cada uno de los siguientes medios: KIA, Citarto de Simmons, TSI, sembrando por picadura al fondo y estría sobre el agar inclinado; SIM y Manitol, sembrando por picadura recta en medio del agar semisólido. Usar el asa de platino recta.
2. Incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar).
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS
1. Fomentar la investigación a través de observar la relación de los medios de cultivo diferenciales y selectivos con rutas metabólicas como expresión del genoma de las especies.
2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.
7. REPORTE DEL ALUMNO
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno,
2. Cowan S. y Steel K. 1985. “Manual para la Identificación de bacterias de importancia médica”. Editorial C.E.C.S.A.
3. Koneman E., Allen S., Dowell V., Sommers H., 1989. “Diagnostico microbiológico. Editorial Médica Panamericana S.A.
4. Martínez A., 1983. “Manual de prácticas de laboratorio”. Edito CREGIT, IT Veracruz.
Prueba Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3
Colonias MAC HEK EMB Coloración de Gram Morfología Catalasa Oxidasa TSI Lactosa Glucosa SH2 SIM Movilidad Indol SH2 RM VP Citrato LIA Lisina SH2 Identificación