Manual Microbiologia FINAL

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I. Objetivo general del manual

Proporcionar al alumno las técnicas y entrenamiento para adquirir la capacidad para el manejo y control de los microorganismos, que permita su uso en procesos

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II. Número, Nombre y Objetivos específicos de cada práctica

Práctica 1. Clasificación, preparación, esterilización y manejo del material utilizando en el laboratorio.

Diferenciará y aplicará los métodos de esterilización adecuada para los diferentes materiales, usando los diferentes equipos del laboratorio.

Práctica 2. Diferenciación. Preparación y esterilización de medios de cultivo.

Aplicará la metodología de preparación y esterilización de diferentes medios de cultivo.

Práctica 3. Determinación de los parámetros de letalidad térmica: valores D-Z. Aplicará las técnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.

Práctica 4. Obtención de cultivos puros, utilizando las diversas técnicas de aislamiento.

Aplicará las técnicas de varilla acodada y estría cruzada para la purificación de cultivos bacterianos.

Práctica 5. Observación colonial y microscópica de cultivos bacterianos.

Obtendrá cultivos bacterianos puros y describirá su morfología colonial y aplicará las técnicas de tinción para su observación de la morfología microscópica.

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Práctica 6. Aplicación de los métodos de preservación de microorganismos y diseño de un cepario.

Aplicará diferentes técnicas para la conservación de cepas microbianas.

Práctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis. Aplicará las técnicas de cultivos anaerobios.

Práctica 8. Identificación de bioquímica de enterobacterias.

Aplicará las técnicas y medios de cultivo para la identificación a través de pruebas bioquímicas del grupo de enterobacterias.

Práctica 9. Aislamiento, cultivo y observación colonial y microscópica de hongos filamentosos y levaduriformes.

Aplicará las técnicas de aislamiento y purificación de hongos y levaduras para su observación de la morfología colonial y tinciones para la observación de su morfología microscópica.

Práctica 10. Producción de ácidos orgánicos por hongos.

Aplicará técnicas de cultivo sumergido para la producción de ácidos orgánicos y evaluará su rendimiento.

Práctica 11. Pruebas de identificación para levaduras.

Aplicará las técnicas de observación microscópica y pruebas bioquímicas para la identificación de levaduras.

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Práctica 12. Recuento en placa.

Aplicará las técnicas de diluciones decimales y técnicas de cultivo para el recuento en placa.

Práctica 13. Técnica del número más probable (NMP).

Aplicará la técnica del número más probable (NMP), y evaluará con sus resultados aplicando las tablas aceptadas por la NOM.

Práctica 14. Curva de crecimiento poblacional en cultivo sumergido.

Aplicará técnicas de cultivo sumergido y conteo microbiano, durante el desarrollo poblacional para observar el modelo de crecimiento.

Práctica 15. Efecto de los agentes físicos y químicos sobre el crecimiento microbiano.

Probará el efecto de diferentes agentes físicos y agentes químicos a diferentes grupos microbianos, evaluará el efecto de los agentes sobre el crecimiento microbiano.

Práctica 16. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Utilizará la técnica de PCR para la amplificación de moléculas de ADN, y evaluará el resultado de la amplificación.

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III. Prácticas de Microbiología

Práctica 1. Clasificación, preparación, esterilización y manejo del

material utilizado en el laboratorio.

1. OBJETIVO

Diferenciará y aplicará los métodos de esterilización adecuada para los diversos materiales, usando los equipos del laboratorio.

2. INTRODUCCION

El conocimiento de las áreas, materiales, equipos, así como el entrenamiento del uso de los mismos en un laboratorio de microbiología permite aplicarlos en cualquier ámbito de trabajo como son el industrial, alimentario, ambiental, investigación, etc. Los procesos que permiten el manejo seguro de áreas libres de microorganismos y poder transferir microorganismos ubicados de un ambiente natural a condiciones controlables de un ambiente artificial, sin contaminación ha permitido el avance de la microbiología como ciencia.

La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismos y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solo elimina formas vegetativas de los microorganismos, los procedimientos que impiden la llegada de microorganismos a un medio dejándolo libre de contaminación o asepsia permite manipularlos.

Los procedimientos de mayor utilización en los laboratorios de microbiología para la esterilización son los métodos de calor seco, calor húmedo y filtración. La esterilización por calor seco produce la destrucción de los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares. Éste es un proceso menos eficiente que la esterilización por calor húmedo, porque los microorganismos mueren con mayor

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rapidez cuando se encuentran en presencia de agua, ya que éste permite que se altere con mayor facilidad la configuración de sus proteínas y proporciona un medio para distribuir el calor uniformemente en toda la cámara interna del equipo de esterilización. Por esta razón, para lograr la esterilización del material empleando el calor seco, se deben aplicar temperaturas más altas durante mayor tiempo, como son desde 150 a 180°C, en un horno durante 2 horas.

Para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos, el más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión de 1 atmosfera, para alcanzar la temperatura de 121ºC, el material se deja a esta temperatura por 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.

Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc., se esterilizan por filtración de membranas estériles de 0.2 micras de diámetro y para el caso de materiales de plástico es recomendable el uso de gases con oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones u.v o compuestos químicos en forma líquida como: fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquil dimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.

3. CORRELACION CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA (ING.

BIOQUIMICA BQO-0525)

Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Esterilización y asepsia.

El manejo de las áreas estériles en forma aséptica para la aplicación de técnicas microbiológicas demanda que el material y los medios de cultivo empleados estén estériles, esto se logra con la selección y aplicación de la técnica de esterilización

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4. MATERIAL Y EQUIPO

Descripción del material Cantidad Equipo

Tubos de ensaye de 18 x 150 mm 10 Autoclave

Cajas de petri 10 Estufa incubadora

Pipetas de 1 ml 10 Horno

Pipeta de 10 ml 1 Mechero Fisher

Probeta de 50 ó 100 ml 1 Campana de flujo laminar Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1

Matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 Vaso de precipitados de 250 ml 1 Pinza de disección de acero inoxidable

de 18 cm

1

Gradilla 1

Tijera

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva y cinta testigo.

5. METODOLOGIA

Preparación del material de vidrio

1.-Lavar perfectamente las cajas de petri, pipetas con escobillón y detergente. 2.- Enjuagar con abundante agua corriente.

3.-Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una pizeta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio.

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4.-Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de petri y pipetas con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaboraran tapones de algodón y gasa procurando que ajuste con holgura, sobre los que finalmente se les colocara un gorro de papel.

Elaboración de gorros

Para tener una base para la elaboración de gorros, se toma como medida, aproximadamente, el tamaño carta; es adecuada para el gorro de un matraz de 500ml.

1.-Se corta papel dextrasa en forma de rectángulo, del tamaño según se necesita. 2.-Se dobla el papel a la mitad con respecto a la parte larga del mismo.

3.- se doblan las puntas superiores, uniéndolas en el centro.

4.-De la parte inferior se dobla hacia arriba al borde de la hoja que queda encima, hasta la altura de las puntas unidas en el paso tres.

5.-Se le da la media vuelta al papel.

6.-Se doblan las puntas de los lados, hasta la altura de donde sobresale el doblez del paso número cuatro.

7.-De la parte interior se dobla hacia arriba, el borde interior sobresaliente de la hoja hasta el doblez anterior.

8.- Se le da la media vuelta al pape obteniéndose de esta manera el gorro.

Elaboración de tapones de algodón

En la elaboración de tapones de algodón, como en el caso de los gorros es importante tener idea del tamaño del algodón a utilizar para obtener un tapón adecuado a las necesidades requeridas.

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Una base para la elaboración: con una tira de algodón de 15-20cm de largo, 3cm de ancho y un grosor de 0.5 cm, y con una gasa de 10x10cm, se obtiene un tapón adecuado para un matraz de 500ml.

1.- Se corta una tira de algodón, de largo adecuado a las necesidades. 2.-Con una pinza de disección se prensa uno de los extremos del algodón. 3.-Se enrolla el algodón en la pinza de manera que quede firme el enrollado.

4.-Seguidamente se corta el cuadro de gasa adecuado a tamaño requerido y se coloca en la boca del matraz, procurando centrarlo.

5.- Con la pinza y el algodón enrollado en ella, la gasa se presiona hasta adentro del matraz, de manera que entre uniformemente por todos lados a la boca de este, dejando a flote la punta superior del algodón. La pinza es sacada del algodón dando una vuelta en sentido contrario al enrollado para a que afloje, y jalando hacia arriba presionando el algodón, con la mano, para que no salga de la boca del matraz.

6.-Hasta este paso deben quedar las cuatro puntas de la gasa colgando de los lados de la boca del, matraz: dos de las puntas que se encuentran opuestamente, se amarran entre si formando un lazo.

7.-Luego se amarran las otras dos puntas restantes, obteniéndose de este modo el tapón de algodón.

Cuando se esterilizan los matraces o tubos, estos deben contener líquido, para evitar que se deterioren por resecamiento del vidrio al calentarse a temperaturas muy elevadas.

Si se utilizan tubos con tapas de rosca, cuando se esterilizan líquidos, estos deberán estar solo semicerrados.

Preparación y envoltura de pipetas

La preparación de las pipetas para su esterilización es muy sencilla, se lavan perfectamente con agua y jabón y se secan por 1 minuto en la estufa a 100°C.

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Con un clip se le introduce en la boquilla de succión un filtro de algodón, de tal forma que el algodón entre suavemente y sin romperse sin la presión de la punta del clip, este tapón tiene una doble función; una es para evitar que en un descuido de succión forzosa, por obstrucción de la pipeta, se ingiera el producto succionado al des taparse bruscamente; y la segunda razón es para evitar que por la boquilla de succión entren microorganismos que alteren los resultados del trabajo realizado. 1.-Se corta una tira de papel aproximadamente 5 cm de ancho y 30cm de largo. 2.-Se doble el extremo interior de aproximadamente 2cm.

3.- Se coloca la pipeta con la punta a la mitad del doblez anterior, y con un ángulo de aproximadamente 20-30 grados de inclinación con respecto a la posición del papel estraza.

4.-Se hace un segundo doblez, tapando la punta de la pipeta con la porción del papel que sobresale a la punta de la pipeta.

5.- Se le hace un tercer doblez a la punta del papel que queda en el ángulo de inclinación, de manera que cubra completamente la punta de la pipeta.

6.- Se da vuelta a la pipeta procurando que el papel vaya envolviéndola en forma de espiral, hasta cubrirla por completo y doblar el papel sobrante dejando este paralelo a la pipeta.

7.-Verificar que el enrollado no quede flojo, en caso de estarlo, reafirmar el papel con respecto a la forma de la pipeta.

8.-Cubrir con cinta adhesiva el último doblez.

Preparación y envoltura de cajas de petri

Al utilizar cajas petri en los cultivos microbianos tienen que ser esterilizados para poder vaciar dichos medios de cultivo que servirán de nutriente a los microorganismos tratados. Estas cajas se pueden esterilizar por calor húmedo o

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calor seco, siendo más recomendable el calor seco, por ser más confiable su efectividad.

Es necesario envolver las cajas petri antes de esterilizarlas para evitar que al término de la esterilización estén expuestas al medio ambiente y se contaminen de nuevo. Para esterilizarlas se puede utilizar un recipiente cilíndrico de metal o envolviéndola en papel estraza.

1.- Se corta papel estraza del tamaño adecuado para el número de cajas que se desee envolver y se colocan las cajas en el centro del papel.

2.-Los bordes de los costados se unen al centro cubriendo las cajas que se envuelven.

3.-En la parte superior se unen los bordes de ambos lados y esta unión se dobla a la mitad, creando una cierre plegado.

4.-Al papel se le presiona a los costados quedando al relieve el volumen de las cajas envueltas en el papel.

5.-Se doblan las puntas del papel de cada una de las esquinas del centro.

6.-Las puntas salientes del papel en los lados de las cajas se doblan hacia arriba y al centro de las cajas y se les asegura con cinta adhesiva.

Esterilización por aire caliente

La esterilización por calor seco se puede realizar por varios métodos: Aire caliente

Flama directa Incineración

Aire caliente.- El aire caliente es uno de los métodos de esterilización por calor seco

más utilizados. Este proceso se lleva a cabo en hornos especiales que permiten la distribución uniforme del calor en su interior, donde el material se expone a temperaturas de aproximadamente 170ºC durante 2 horas. El tiempo de

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esterilización se debe determinar para cada tipo de material, por ejemplo en el caso de materiales muy resistentes al calor, se pueden usar temperaturas más altas por tiempos más cortos. Entre las ventajas de este método de esterilización están que no deja residuos, y es un método rápido y económico. Además permite la esterilización de materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas. Su principal desventaja es que sólo debe emplearse para esterilizar materiales termoestables. Para controlar este proceso de esterilización se utilizan indicadores físicos tales como los termómetros, los cuales permiten medir la uniformidad de la temperatura de la cámara interna del horno, indicadores químicos como las cintas testigo.

El material de vidrio moderno permite la carga y descarga en caliente sin que se rompa, pero hay siempre un ligero riesgo de que el aire no estéril puede ser succionado hasta el interior de las cajas petri no envueltas mientras se enfrían.

Cuando se cargan debe dejarse espacio entre cada artículo, puesto que la carga excesiva impide la circulación de aire y determina puntos calientes y fríos.

La esterilización por aire caliente se utiliza principalmente para el material de vidrio como son: Cajas petri, tubos de ensaye, pipetas, sin líquidos en su interior, material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, material y utensilios de metal.

Flama directa.- Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que éste

se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas. Su eficacia depende de la calidad de la llama. Es un procedimiento muy sencillo que se realiza de rutina en los laboratorios de microbiología para esterilizar el asa o el filamento con la llama del mechero. Cuando se realiza este procedimiento se debe evitar la formación de aerosoles (pequeñas gotas liberadas al aire) que podrían contaminar el ambiente.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS

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laboratorio y generar criterios de selección de los métodos más adecuado para los distintos tipos de materiales que se manejen en el laboratorio.

2. Vincular los resultados obtenidos mediante experimentos de esterilización de diferentes materiales y medios de cultivo en el laboratorio con los conocimientos teóricos y su experiencia con el entorno a través de la discusión en grupo.

7. REPORTE DEL ALUMNO

1. Escribir las diferencias entre esterilización y asepsia.

2. Escriba la finalidad de manejar un área estéril si el material a usar y los medios fueron esterilizados previamente.

3. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Descripción del material Método de esterilización Indicador de esterilización Resultado Observaciones

Pipeta Método y parámetros de control

etc

4. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen.

5. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana.

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3. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill. 4. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html

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Práctica 2. Diferenciación, preparación y esterilización de medios de

cultivo.

1. OBJETIVO

Aplicará la metodología de preparación y esterilización de diferentes medios de cultivo.

2. INTRODUCCION

La ubicuidad de los microorganismos se relaciona con las capacidades de cada uno de estos y sus especificidades en adaptarse a las condiciones medioambientales con sus mecanismos enzimáticos y sus relaciones poblacionales en un ecosistema. Para crecer, los microorganismos deben tomar del ambiente todas las sustancias necesarias para la síntesis de sus componentes celulares y para la generación de energía. Estas sustancias se denominan nutrientes. Un medio de cultivo artificial deberá contener todos los nutrientes y las cantidades necesarias a los requerimientos específicos para el microorganismo que quiere ser aislado.

La formulación de un medio de cultivo está basada en los principios de la nutrición y la composición química de las células, como ejemplo el agua es el componente principal que se encuentra entre un 80 y 90% del peso total de la célula, por lo cual es el componente y nutriente principal y esencial, en términos cuantitativos. Los componentes sólidos en la célula son constituidos hasta en un 95% por las sustancias en las cuales sus componentes elementales son el carbono, nitrógeno, fósforo y azufre, ordenados en forma decreciente con relación a su abundancia. El carbono es el componente principal del peso seco de una célula, participando comúnmente con un 50%, los microorganismos fotosintéticos toman esencialmente del CO2 su fuente de carbono y toman de los compuestos inorgánicos oxidándolos y

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de la luz su energía. Todos los demás organismos toman su fuente de carbono de sustancias orgánicas además de utilizarla como principal fuente de energía.

Los microorganismos son extraordinariamente diversos tanto a la clase como al número de compuestos orgánicos que pueden usar como fuente principal de carbono y energía. Esta diversidad se manifiesta en el hecho de que no hay en la naturaleza ningún compuesto orgánico que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y energía por algún microorganismo, por lo que algunos muestran una gran versatilidad y otros extremadamente especializados en el uso de la fuente de carbono orgánico, estas características permiten diseñar diferentes tipos de medios de cultivo como son: Por su contenido de agua el medio líquido, semisólido y sólido; Por su composición cualitativa y cuantitativa de su componentes, medio complejo, semisintético y sintético; Por su capacidad de soportar microorganismos, medio general, selectivo; diferenciales, ricos, etc.

En la actualidad los medios de cultivo comúnmente empleados, se encuentran en el comercio bajo la forma de productos deshidratados, presentado ventajas como son: estabilidad, fáciles de usar, una pequeña cantidad del polvo basta para preparar una cantidad de medio de cultivo, necesitan poco espacio para almacenarse y de alguna manera son económicos.

Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Medios de cultivo.

El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes semejantes de donde fue extraído.

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Agar nutritivo (g/l) 23 Autoclave

Caldo nutritivo (g/l) 8 Estufa incubadora

Cajas petri 10 Horno

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

10 Mechero Fisher

Probeta de 100 ml 1 Campana de flujo laminar Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 Potenciómetro

matraz Erlenmeyer de 500 ml 1

gradilla 1

Asa de nicromo 1

Asa varilla de vidrio 1

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, muestra de tierra y agua fresca.

5. METODOLOGIA Preparación:

1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (Caldo nutritivo 0.8 g para 100 ml y agar nutritivo 4.6 g para 200 ml).

2. Disolver al inicio en una cantidad de la fracción del volumen total de agua.

3. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las paredes del recipiente.

4. Calentar suavemente entre 50 y 60°C, agitando constante el recipiente hasta su incorporación del medio al agua o clarificar, en caso de un medio contenga agar,

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espere 5 minutos agitando antes de llevarlo a ebullición. (Nunca sobrecaliente, uno o dos minutos de ebullición es suficiente).

5. Revise el valor indicado en la etiqueta del pH y de ser necesario ajústelo utilizando soluciones ácidas o bases con concentraciones de 0.1 M.

6. Antes de su esterilización vierta en cada tubo 9 ml de caldo nutritivo y cierre suavemente el tubo con el tapón de rosca.

7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri deberán esterilizarse previamente por separado.

8. Los medios deshidratados son altamente higroscópicos, por lo que es necesario mantenerlos convenientemente cerrados los frascos después de utilizarlos y mantenerlos en un lugar fresco, seco y protegidos de la luz.

9. La esterilización, en todos los casos es conveniente seguir las instrucciones indicadas en las etiquetas de los frascos y nunca deberá exceder la temperatura de esterilización. (Caldo y agar nutritivo se esteriliza a 121°C a 1 atm de presión manteniendo estas condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta testigo para cada lote).

10. Los tubos con el caldo nutritivo se cierran después de su esterilización y que estos estén a una temperatura entre 50 y 60°C.

11. El agar nutritivo estéril se vacía a las cajas petri cuando éste alcance una temperatura entre 45 y 50°C.

12. Los medios preparados es recomendable utilizarlos el mismo día de su preparación, sin embargo es posible mantenerlos por varios días en refrigeración, debiéndose llevar a temperatura ambiente antes de usarse.

13. Inocule el caldo nutritivo y el agar nutritivo con las muestras de los distintas fuentes de microorganismos.

14. Incube las cajas y tubos inoculados en la estufa de incubación a 35°C. 15. Observe el desarrollo de su crecimiento a las 24 y 48 horas de incubadas.

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2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.

1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo. 2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados:

Medio de cultivo Fuente del microorganismo Forma de Crecimiento Resultado Observaciones

Líquido Muestra sólida Líquido Muestra líquida Sólidor Muestra sólida Sólidor Muestra líquida

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A.

2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill.

4. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar. 5. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html.

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Práctica 3. Determinación de los parámetros de letalidad térmica:

valores D-Z.

1. OBJETIVO

Aplicará las técnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.

2. INTRODUCCION

La tecnología microbiana y alimentaria requiere que sus procesos sean operados sin contaminación biológica. En general se necesita un alto grado de limpieza y se procura que las operaciones sean asépticas.

Para mantener un proceso en condiciones asépticas sería necesario contar con un método cuantitativo seguro y confiable de medir la concentración de contaminantes que entran al proceso, además que cada contaminante en particular varia su efecto potencial sobre el proceso.

Dentro de los métodos utilizados por la industria para esterilizar sus procesos el más empleado es la destrucción por calor, en el cual el concepto básico es la mortalidad térmica, la cual intenta explicar el mecanismo de inactivación térmica de los microorganismos, en lo particular en nuestro caso solo se tratará el aspecto cinético. La destrucción de los microorganismos depende de muchas variables: pH de medio, estado vegetativo o esporular de las células, iones metálicos, etc. La destrucción de los microorganismos sigue una reacción de primer orden, es decir la tasa de mortalidad en cualquier tiempo es proporcional al número de células vivas a una temperatura específica.

dN/dt = -k N

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logaritmo del número de células vivas y el tiempo de esterilización, esta relación se conoce como la Ley logarítmica de mortalidad.

Dentro de las expresiones para la taza de esterilización, se tienen las siguientes: PMT.- Punto de muerte térmica es la temperatura mínima requerida para

destruir la totalidad de los microorganismos.

TMT.- Tiempo de muerte térmica es el tiempo requerido para destruir todas las células a una temperatura determinada.

Método del porcentaje.- Porcentaje de células sobrevivientes a la exposición al calor por unidad de tiempo.

TRD.- Tiempo de reducción al décimo es el tiempo que tarda un número de células en reducirse al 10% y su valor es D.

Z.- Son los grados de temperatura necesarios para reducir el tiempo de destrucción térmica diez veces.

Ln 10 = kt t = D = 2.3/k

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3. CORRELACION CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA (ING. BIOQUIMICA BQO-0525)

Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Muerte térmica y valores D y Z.

Los tratamientos térmicos a los materiales o alimentos permiten mantener condiciones para poder trabajar libres de contaminación y dar más tiempo de anaquel.

Para cada tratamiento térmico.

Cajas petri 40 Horno

25 Baño metabólico con control de temperatura Probeta de 100 ml 1 Campana de flujo laminar Matraz Erlenmeyer de 1000 ml 1 Potenciómetro

Matraz Erlenmeyer de 500 ml 2 Mechero Fisher

gradilla 1 Centrifuga

Asa varilla de vidrio 1 Micropipeta de 0.1 a 1 ml Tubos para centrifuga 10 ml 10 Vortex

Pipetas de 1 ml 10

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5. METODOLOGIA Soluciones

1. Solución salina al 0.85 % .- Colocar 8.5 g de NaCl en un matraz volumétrico de 1000 ml; disolver y llevar a volumen con agua destilada.

2. Hidróxido de sodio 1 N.- En un matraz volumétrico de 100 ml, pesar 4.0 g de NaOH disolver y aforar con agua destilada.

3. Solución amortiguadora de fosfatos.- Disolver 34 g de fosfato monobásico de potasio en 500 ml de agua destilada; ajustar el pH a 7.2 con hidróxido de sodio 1 N. Se requieren aproximadamente 175 ml. Diluir a 1000 ml con agua destilada, esterilizar durante 20 min a 121°C y conservar en refrigeración hasta su uso. 4. Solución de trabajo.- A 1000 ml de solución salina al 0.85 %, adicionar 1.25 ml de

solución amortiguadora de fosfatos; si es necesario, ajustar el pH a 7.2.

5. Transferir 9 ml de solución de trabajo en 20 tubos con tapón de rosca y esterilizar.

Paquete Celular

1. Crecer el microorganismo seleccionado durante 24 horas, en un matraz de 500 ml con un volumen de 200 ml de medio de cultivo.

2. Centrifugar, y resuspender en 20 ml de la solución de trabajo el paquete celular. Refrigerar hasta su transferencia.

Sobrevivencia térmica

1. Transferir 1 ml del paquete celular resuspendido en la solución trabajo a cada uno de los 20 tubos conteniendo 9 ml de solución de trabajo estéril.

2. Mantener los tubos bajo las condiciones de tratamiento térmico siguientes: a. 100°C b. 105°C c. 110°C d. 115°C e. 120°C f. 125°C

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3. Por cada temperatura, obtener muestras por triplicado a los siguientes tiempos (minutos): 1, 2, 4, 8, 16, 25. Tomar 2 tubos como muestra control (tiempo 0). 4. Determinar viabilidad celular en cada una de las muestras.

5. Graficar los resultados.

6. Determinar los valores de D y Z.

1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto del tratamiento térmico y su influencia en la muerte térmica de los microorganismos.

2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos y muestras utilizados.

1. Calcule los valores de D y Z.

2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Tratamiento térmico (°C) Tiempo (minutos) Concentración celular (viables) Observaciones

100 0, 1, 2, 4, etc Número/ml, etc 105 0, 1, 2, 4, etc Número/ml, etc etc

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8. BIBLIOGRAFIA

2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill.

5. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.

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Práctica 4. Obtención de cultivos puros, utilizando las diversas

técnicas de aislamiento.

1. OBJETIVO

Aplicará las técnicas de varilla acodada y estría cruzada para la purificación de cultivos bacterianos.

2. INTRODUCCION

Un cultivo puro es aquel que se desarrolla a partir de una célula única y que pertenece a la misma especie y cepa. Obtener un cultivo puro es uno de los problemas en la microbiología, ya que el estudio organizado de cualquier organismo requiere que se le examine una especie a la vez, el método analítico no se puede aplicar cuando hay más de una.

Idealmente, uno debería aislar una sola célula individual y luego transferirla a un medio estéril hasta que se divida para generar una sola población a la cual se le denomina clona y, en este caso tener un cultivo puro.

Generalmente las bacterias son inoculadas e introducidas en medios líquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conservación, como para estudiar sus características de crecimiento. Es importante recordar que la inoculación de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre deben realizarse en zona aséptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.

Los cultivos puros al estar formados por un solo tipo de microorganismos; nos permite conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad química, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos e identificación a las especies microbianas; para todo esto se utilizan las técnicas de aislamientos quienes permiten

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alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos, esto se logra con las técnicas de aislamiento y s purificación.

Una manera para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, es aplicar métodos de cultivos especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes como: antibióticos, altas concentraciones de sales y/o pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés.

SIEMBRA.-Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra

(inóculo) en un medio adecuado que provee los requerimientos necesarios, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, la creencia de transferir una gran cantidad del material de cultivo para tener éxito es un error. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizar en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo o pipeta estéril, etc.

Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Métodos y técnicas de aislamiento y selección. Tema. Microorganismos procariotas.

Subtema. Morfología y estructura bacteriana; Reproducción bacteriana.

El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes que le den ventajas de crecer al microorganismo de interés, a través de técnicas de siembra que permiten obtener un cultivo puro.

(28)

Cajas petri 20 Estufa incubadora

10 Horno

Probeta de 100 ml 1 Campana de flujo laminar Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 Potenciómetro

Matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 Mechero Fisher

gradilla 1 Vortex

Asa de platino 1

Asa de varilla acodada 1

Pipetas de 1 (ml) 10 Alcohol 96° (ml) 100 Vaso de precipitado 500 ml 1 Lactosa (g/l) 10 NH4H2PO4 (g/l) 2 K2HPO4 (g/l) 5 MgSO4 (g/l) 1 KCl (g/l) 0.2 Purpura de bromocresol (ml) 1 Agar bacteriológico (g/l) 15

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5. METODOLOGIA Preparación del material

1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (agar nutritivo 4.6 g para 200 ml para 10 cajas petri).

2. Pesar las sales y lactosa calculando para la preparación de 200 ml. (para 10 cajas petri).

3. Disolver al inicio en una cantidad de la fracción del volumen total con agua.

4. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las paredes del recipiente.

5. Calentar suavemente entre 50 y 60°C, agitando constante el recipiente hasta su incorporación del medio al agua o clarificar, espere 5 minutos agitando antes de llevarlo a ebullición. (Nunca sobrecaliente, uno o dos minutos de ebullición es suficiente).

6. Prepare 5 tubos con 9 ml con la solución de trabajo (solución salina y amortiguador de fosfatos) para hacer las diluciones decimales y cierre suavemente el tubo con el tapón de rosca.

7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri deberán esterilizarse previamente por separado.

8. La esterilización por autoclave a 121°C a 1 atm de presión manteniendo estas condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta testigo para cada lote).

9. Los tubos con las diluciones decimales se cierran después de su esterilización y que estos estén a una temperatura entre 50 y 60°C.

10. El agar nutritivo estéril se vacía a las cajas petri cuando éste alcance una temperatura entre 45 y 50°C.

Aislamiento

1. Cernir la muestra de tierra y pesar 1 g.

2. Transferir la muestra de tierra al primer tubo (1) con la solución de trabajo estéril. 3. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra.

4. Tomar 1 ml del tubo (1) y transferirlo al siguiente tubo (2) con la solución de trabajo estéril.

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5. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra.

6. Tomar 1 ml del tubo (2) y transferirlo al siguiente tubo (3) con la solución de trabajo estéril.

7. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra.

8. Repetir el procedimiento hasta agotar los tubos con solución de trabajo estéril. (serie de diluciones decimales de 1/10, 1/100, etc.)

9. Inocular por duplicado (transferir 0.5 ml de las diluciones decimales 1,3 y 5) a los medios de agar nutritivo y agar de lactosa.

10. Extender la alícuota con el asa de varilla acodada (previamente esterilizada con alcohol) en toda la superficie de la caja petri con el medio de cultivo no presionando el agar.

11. Incubar a 35°C y observar cada 24 horas, por 3 días.

12. Escoger 2 colonias aisladas diferentes y marcarlas con un circulo (por fuera de la caja).

Purificación

1. Esterilizar el asa de platino en la llama directa del mechero, que esté en contacto con la parte exterior de llama en posición vertical hacia abajo (20-30°).

2. Transfiera la colonia seleccionada a una caja de petri estéril con medio fresco, tocando sobre la colonia y sembrar con la técnica de estría cruzada.

3. Incubar a 35°C, durante 24 horas, observar colonias separadas y que solo exista un solo tipo de colonia.

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1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto de los diferentes medios de cultivo en los microorganismos.

2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos y muestras utilizados.

1. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Medio de

cultivo

Dilución decimal Colonias diferentes

Observaciones

Agar nutritivo 1, 3, 5 Número/característica Agar de lactosa 1, 3, 5 Número/característica

8. BIBLIOGRAFIA

2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill.

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5. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.

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Práctica 5. Observación colonial y microscópica de cultivos

bacterianos.

1. OBJETIVO

Obtendrá cultivos bacterianos puros y describirá su morfología colonial y aplicará las técnicas de tinción para su observación de la morfología microscópica.

2. INTRODUCCION

Una bacteria simple esta formada por tres capas externas que envuelven las estructura internas; la capa pegajosa protege la pared celular rígida, que a su vez cubre la membrana celular semipermeable.

El flagelo es un medio de locomoción y los pelos que se extienden por fuera de la cápsula, ayudan la bacteria a sujetarse de las superficies.

Hay dos grupos principales de bacterias: las saprofitas, que viven sobre los cuerpos muertos de animales y vegetales, y los simbiontes, que viven en animales o plantas vivas. Las saprofitas son importante s por que descomponen los cuerpos de plantas o animales muertos en sus componentes esenciales, haciendo se accesibles para ser utilizados como alimento por las plantas. Muchas bacterias simbiontes se encuentran en condiciones normales, en los tejidos humanos, incluso en el tubo digestivo y la piel, donde pueden resultar indispensables para los procesos fisiológicos este tipo de relación recibe el nombre de mutualismo. En el comensalismo, las bacterias simbiontes obtienen los nutrientes de sus huéspedes vivos causándoles un daño considerable. El tercer tipo los parásitos, pueden provocar la destrucción de las plantas o los animales en los que viven.

Cada bacteria es una porción microscópica de materia viva sin un núcleo bien definido. En su mayoría las bacterias son incoloras, aun que algunas tienen sustancias y colorantes. Por término medio miden una micra (0.001mm) de diámetro.

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En cuanto as tipo de agrupación pueden ser, respecto a los cocos: Diplococos, se agrupan de dos en dos; estreptococos, si se agrupan en fila, tetra cocos, si se agrupan en cuatro; sarcinas, si forman cubos; estafilococos si lo hacen en racimos. También se caracterizan algunas bacterias por la facultad que tienen de producir cuerpos ovales de pared gruesa (una por célula) que es una célula de alta resistencia llamada endospora o más comúnmente espora. Todos los organismos del género Bacillus y Clostridium se caracterizan por su capacidad de producir esporas.

Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas

Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios utilizados en la identificación de microorganismos

Tema. Microorganismos procariotas.

La observación de la morfología colonial y microscópica de las bacterias, permite determinar el tamaño, forma, agrupación, características de sus estructuras como la membrana, pared celular, esporas, etc., lo cual ayuda para su clasificación.

Cajas petri 2 Microscopio

Portaobjetos (caja por equipo) 1 Mechero bunsen Cubreobjetos (caja por equipo) 1

Cultivo bacteriano 1

Aceite de inmersión 1

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Asa de Platino 1 Alcohol 96° (frasco de 500 ml, por

equipo)

1

Algodón, cinta adhesiva, papel absorbente, cultivo puro (joven).

5 METODOLOGIA

Para las observaciones de las características macroscópicas se estudia el tiempo de colonia formada por cepa.

Procedimiento

1.-Del cultivo puro de la cepa se toma una asada y empleando la técnica de estría cruzada se inocula una caja petri con agar nutritivo.

2.-Se incuba durante 24-48 horas, después de la caja se escoge para la observación una colonia aislada.

3.-Se hace la observación de la colonia.

Observación de morfología colonial

a) Edad: tiempo transcurrido a partir e la inoculación b) Tamaño de la colonia: Diámetro de la colonia. c) Color: se compara con un catalogo de colores.

d) Consistencia: suave, dura, cremosa, otras (especificar)

e) Luz translúcida, puede ser: transparente, translúcida u opaca.

f) Borde: entero, ondulado, gastado, filamentoso, arborescente, ensortijado. g) Elevación: esparcida, plana, elevada, convexa, encazoleta, umbilicada. h) Estructura interna: Homogénea, granulosa y rizada.

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i) superficie. Pudiendo ser; lisa, rugosa, anular.

Observación morfología microscópica

Para las observaciones microscópicas se procede de la siguiente manera: De la caja de cultivo puro se toma una azada.

Se hace un frotis fijo. Preparación de frotis fijo

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra.

Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos.

Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos.

Cuando se trata de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo.

El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad.

El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme y se coloca el portaobjetos sobre un vaso de precipitados.

A continuación se tiñe la muestra:

Se le adiciona cristal violeta por un minuto,

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Se le agrega alcohol-cetona durante 10 o 15 segundos,

Se le agrega safranina por un minuto, después se lava suavemente con un chorro de agua hasta que el agua salga sin colorante.

Una vez que la preparación está totalmente seca, observar en los objetivos de 10, 45, y 100x, poniendo en este último el aceite de inmersión.

6 SUGERENCIAS DIDACTICAS

1 Fomentar la investigación a través de observar las tinciones y el tipo de microorganismo aislado en el cultivo puro.

2 Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos cepas puras y su morfología colonial y microscópica.

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7 REPORTE DEL ALUMNO

1. Describir en una tabla y figura la morfología colonia y microscópica de cada cepa pura observada.

Morfología colonial

Forma Elevación Borde

Forma de Crecimiento

Estría en agar Picadura en gelatina Crecimiento en caldo Forma Línea Licuefacción Medio Superficie

Puntiforme Plana Entero Filiforme Filiforme Crateriforme Floculenta Peliculada Circular Elevada Ondulado etc etc Etc etc etc Filamentosa Convexa etc

Amiboide etc etc

Morfología microscópica

Edad del cultivo Tinción Forma unicelular Modo de agrupación

(hrs) Gram ( ) Bacilo Células sueltas Acidorresistente Coco Diplos

etc etc etc

8 BIBLIOGRAFIA

2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill.

(39)

5. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.

6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar. 7. www.escuelasecundariaanexa.com.mx

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Práctica 6. Aplicación de los métodos de preservación de

microorganismos y diseño de un cepario.

1. OBJETIVO

Aplicará diferentes técnicas para la conservación de cepas microbianas.

2. INTRODUCCION

Desde tiempos remotos los microorganismos han sido empleados como materiales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables.

La preservación de cepas microbianas no es tarea fácil y debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación. El conocimiento de las peculiaridades de las disímiles técnicas de preservación existentes para su correcta aplicación, así como el seguimiento continuo de las propiedades de las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la docencia y la investigación.

Con frecuencia la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos, número y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como la frecuencia del uso de los cultivos.

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Subcultivos:

Alta probabilidad de que se produzcan mutaciones, alto riesgo de contaminación, escasa vialibidad a largo plazo.

Conservación a bajas temperaturas:

En placas de agar

Conservación de las esporas en agua Conservación en congelación

Se requiere el uso de crioprotectores (DMSO, glicerol, trehalosa), las temperaturas más utilizadas son –80ºC y mediante nitrógeno líquido entre –150 y –196ºC, se recomienda una congelación lenta y una descongelación rápida, buena estabilidad genética, suele ser caro mantener temperaturas tan bajas.

Conservación en forma deshidratada:

Cultivos con aceite mineral Liofilización

Es un método muy utilizado, tiene buena estabilidad genética, es una técnica sofisticada.

Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas

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La conservación de microorganismos en los laboratorios y la industria permite poder disponer de los microorganismos en el momento que se requiera, además de poder realizar todos los trabajos necesarios para su clasificación y determinar sus características de interés.

Caldo nutritivo 8 Horno

Cajas petri 4 Estufa incubadora

30 Campana de flujo laminar

Tubos de 2 ml para microcentrifuga 20 Refrigerador

Probeta de 100 ml 1 Mechero Fisher

Matraz Erlenmeyer de 250 ml 2 Vortex

Matraz Erlenmeyer de 125 ml 5 Microcentrifuga

gradilla 1

Asa de platino 1

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo

5. METODOLOGIA

Preparación de la muestra

1. Incubar de 24 a 48 horas en medio líquido un cultivo puro hasta alcanzar concentraciones de 107 a 108 células/ml, para poder obtener un paquete celular. 2. Centrifugar y obtener el paquete celular resuspender las células con la menor

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3. Incubar de 24 a 48 horas en cultivo sólido un cultivo puro, aplicando la técnica de estría cruzada, seleccionar las colonias separadas.

4. Preparar tubos de 18x150 mm con tapón de rosca con 10 ml de agar nutritivo, esterilizar y al sacar los tubos de la autoclave inclinar hasta que el menisco del agar este a 2 cm del cuello de la rosca del tubo, esperar hasta que gelifique. (tubos con agar inclinado).

5. Esterilizar 100 ml de aceite mineral en un matraz de 250 ml.

6. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapón de rosca conteniendo 2 gramos de sílica gel.

7. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapón de rosca conteniendo 2 gramos de tierra cernida.

Aplicación de la técnica de conservación

Resiembra periódica:

1. Transferir por triplicado las colonias seleccionadas del cultivo puro joven al tubo de agar inclinado, aplicando la siembra de estría a todo lo largo del medio inclinado.

2. Incubar los tubos sembrados utilizando las mismas condiciones ambientales de donde proviene, esperar hasta tener un buen crecimiento del cultivo puro.

3. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 3 y 4 del paso de preparación de la muestra y todos de la resiembra periódica).

4. Los tubos con las cepas crecidas podrán añadirles el aceite mineral hasta cubrir todo el agar inclinado, refrigerar hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 3, 4 y 5 del paso de preparación de la muestra y todos de la resiembra periódica). 5. Etiquetar todos tubos de conservación antes de refrigerar, con la siguiente

información: cepa, clave de identificación, medio de cultivo utilizado, fecha de siembra, fecha de resiembra, número de resiembra, nombre del alumno, institución, carrera, asignatura.

Deshidratación:

1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con sílica gel, cerrar y dejar reposar 12 horas permitiendo que se efectué la deshidratación. (usado principalmente para cepas productoras de esporas).

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2. Refrigerar los tubos con las cepas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 1, 2 y 6 del paso de preparación de la muestra y todos de la deshidratación).

Limitación de nutrientes:

1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con suelo estéril, cerrar y dejar reposar por 12 horas y refrigerar posteriormente. (el suelo está limitado en nutrientes y por estar seco atrapa la humedad de las células secándolas, esta técnica es muy económica empleándose principalmente para cepas que esporulan).

2. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 1, 2 y 7 del paso de preparación de la muestra y todos de la limitación de nutrientes).

1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto de los métodos de conservación sobre la sobrevivencia de las cepas.

1. Escribir las diferencias de las técnicas de conservación. 2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Técnica de conservación Costos de conservación Dificultad de la técnica Resultado Observaciones

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8. BIBLIOGRAFIA

2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill.

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Práctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis.

1. OBJETIVO

Aplicará las técnicas de cultivos anaerobios.

2. INTRODUCCION

La presencia de una atmósfera terrestre rica en oxígeno permitió a los seres vivos evolucionar desarrollando un metabolismo aeróbico, el cual se caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtención de energía. Las bacterias anaerobias precedieron largamente a las aeróbicas y sin duda, predominaron largamente en un mundo vivo que comenzaba a desarrollarse.

El reconocimiento de la naturaleza anaerobia de determinados microorganismos se acredita a Pasteur, quien en 1863 observó que la motilidad de ciertas bacterias desaparecía con la exposición al aire.

El conocimiento sobre las bacterias anaerobias es poco y relativamente reciente, ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el laboratorio se necesitaban, hasta los años 60, equipos costosos y técnicas bacteriológicas muy dificultosas. A partir de la introducción de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo, el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente. Aun así, no hay un gran número de microbiólogos que se dediquen al tema, la taxonomía está en permanente revisión e infinidad de aspectos se mantienen oscuros.

Anaerobios son aquellos gérmenes que sólo pueden desarro llarse en ausencia de cantidades significativas de oxígeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox (Eh) muy reducidos, por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al oxígeno molecular libre en la atmósfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados

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por tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy escasa proporción de agua en su composición.

Si bien se considera bacteria anaerobia aquel germen que puede crecer sólo en ausencia de oxígeno, la sensibilidad frente al oxígeno varía ampliamente de una especie a otra. Así, distinguimos bacterias microaerófilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados. Las bacterias microaerófilas resultan dañadas por niveles altos de oxígeno como el atmosférico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%. Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos que toleran exposiciones breves al oxígeno atmosférico desarrollando óptimamente en condiciones anaerobias. Los anaerobios estrictos no toleran el oxígeno y mueren en su presencia, por tanto sólo desarrollan en condiciones anaerobias; (de aquí en adelante los denominaremos simplemente anaerobios).

Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual sustancias orgánicas son los aceptores finales de electrones, aunque también pueden obtener energía a partir de la respiración anaerobia. Otras características comunes a los microorganismos anaerobios son sus requerimientos nutricionales complejos, su lento crecimiento y su labilidad, lo cual, sumado a sus requerimientos atmosféricos estrictos (de O2 y CO2) hace que su aislamiento sea difícil; además, al ser la mayoría de las infecciones mixtas (aerobios y anaerobios) otros microorganismos menos exigentes y de crecimiento más rápido pueden crecer e inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias.

Otro factor crucial para el éxito en el aislamiento de anaerobios es el transporte adecuado de la muestra. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos nocivos del oxígeno atmosférico durante el tiempo que transcurre entre la extracción y la siembra anaeróbica de la muestra. La primera y más efectiva medida es “correr” ya que en ninguna otra ocasión como esta el envío inmediato al laboratorio es tan fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente disponibles en los que se ha sustituido el aire por otro gas, como CO2 o N2, denominados tubos gaseados y que contienen un indicador de anaerobiosis. Dichos tubos sirven para el transporte de

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muestras líquidas que se inyectan a través de un tapón de goma luego de eliminar todo el aire de la jeringa y aguja.

Luego de sembrar la muestra en un medio de cultivo adecuado, la incubación en anaerobiosis se consigue por medio de alguno de los siguientes sistemas: jarras anaeróbicas, bolsas de anaerobiosis y la cámara de anaerobiosis o “cámara de guantes”. El último método es muy caro, requiere equipamiento complejo, es lento y se usa para estudios de flora normal y en laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista práctico las jarras y los sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los sistemas más sofisticados y son aceptables para el aislamiento de bacterias anaerobias en el laboratorio clínico. Con estos sistemas son posibles los cultivos en medios sólidos para la obtención de aislamientos que permitan la identificación bacteriana.

Jarras de anaerobiosis

Es el sistema más utilizado para generar una atmósfera anaeróbica. Consiste en una jarra de plástico con una tapa que cierra herméticamente. La atmósfera anaerobia puede lograrse por dos métodos diferentes. El más sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrógeno y CO2 que es activado, ya sea mediante la adición de agua o por la humedad de las placas de agar. El H2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta reacción es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra. El segundo método consiste en la extracción del aire contenido en la jarra a través de la generación de vacío, sustituyendo el mismo por otro gas libre de O2 como el nitrógeno. El contenido final de la jarra consiste en una mezcla de gases conteniendo generalmente 80-90% de nitrógeno, 5-10% de hidrógeno y 5-10% de CO2. Una tirilla de papel impregnada en azul de metileno (azul en presencia de O2, incoloro en su ausencia) introducida en la jarra es el indicador de anaerobiosis.

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El cultivo de los microorganismos anaerobios en condiciones artificiales se logra con una adecuada toma y manejo de la muestra (condiciones anaeróbicas), incubando para su desarrollo en ambientes anaeróbicos.

Caldo tioglicolato (g/l) Autoclave

Agar gelosa sangre Jarra de anaerobiosis

Agar tripticasa sulfato de neomicna y polimixina TSN (g/l)

Horno

Aceite mineral (ml) 8 Mechero Fisher

Cajas petri 10 Campana de flujo laminar

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca 20 Vortex Probeta de 100 ml 1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 Vaso de precipitados de 500 ml 1 gradilla 1 Asa de platino 1

(50)

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo.

5. METODOLOGIA

1. Colocar 1 gramo de muestra en solución de trabajo, homogenizar con el vortex y dejar sedimentar.

2. Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estría cruzada en una placa de agar TSN.

3. Incubar a 37°C durante 48 horas en una jarra de anaerobiosis conteniendo sílica gel en el fondo, introducir un indicador de oxido-reducción (papel filtro impregnado con azul de metileno).

4. Meter el sobre generador de H2 y CO2 (gas pak) y adicionar 10 ml de agua en el interior de sobre para activarlo.

5. Cerrar inmediatamente la jarra.

6. Homogenizar la muestra en el tubo y calentar a ebullición durante 10 minutos. 7. Dejar enfriar y esperar que sedimente.

8. Repetir los puntos del 2 al 5.

1. Fomentar la investigación a través de observar el cultivo de la muestra.

1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo. 2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados:

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Medio de cultivo Morfología de la colonia Forma de Crecimiento Resultado Observaciones Tinción gram

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, 2. Cowan S. y Steel K. 1985. “Manual para la Identificación de bacterias de

importancia médica”. Editorial C.E.C.S.A.

3. Martínez A., 1983. “Manual de prácticas de laboratorio”. Edito CREGIT, IT Veracruz.