El SDC esencial de S pneumoniae controla el metabolismo de la pared celular

El análisis transcriptómico de las estirpes con niveles alterados del SDC YycFG reveló en todas ellas la existencia de alteraciones en la expresión de los genes implicados en el metabolismo de la pared celular (Tablas S2, S3 y S4). En concreto se detectó un incremento de la transcripción de los genes pcsB, lytB y de otros dos genes (SP0107 y SP2063), que también codifican proteínas que contienen dominios LysM de unión a la pared celular. También se detectó una disminución de los niveles de expresión de los genes mreCD implicados en la morfogénesis celular en bacterias gram negativas y gram positivas (Osborn y Rothfield, 2007; Hayhurst et al., 2008). Estos resultados están correlacionados con los obtenidos por Ng y cols. (2003 y 2004), que detectaron una respuesta contraria y complementaria en los niveles de la expresión de la mayoría de los genes antedichos cuando disminuyó la expresión del SDC cromosomal en la estirpe R6, utilizando el promotor regulable del operón implicado en la utilización de fucosa. Además, tanto con la hiperproducción (Mohedano et al., 2005) como con la disminución (Ng et al., 2003) de los niveles del SDC YycFG, se han detectado alteraciones en la morfología de las células, produciéndose una acumulación anómala del DNA (Fig. 30 y 36) (Ng y Winkler, 2004; Giefing et al., 2008). Estas alteraciones morfológicas son similares a las observadas cuando en las células se reducen los niveles de PcsB (Ng et al., 2004), una putativa mureína hidrolasa localizada en la membrana plasmática y que se libera al medio de cultivo (Mills et al., 2007).

Ng y cols. (2005) demostraron que existe una regulación directa de YycF sobre PcsB detectando, por ensayos de footprinting utilizando DNasa I, una región protegida por YycF en la región promotora de pcsB que contiene la secuencia de reconocimiento de DNA (5´-TGTAAC-N5-CGTAATA-3´) (Fig. 54A). Ensayos de retraso en gel realizados por el grupo del Dr. Winkler mostraron que YycF en sus dos formas (fosforilada y sin fosforilar) podía unirse a la región promotora de pcsB, postulando que la unión de YycF fosforilado era mucho más fuerte y específica, aunque no calcularon las constantes de afinidad. Además, los ensayos mostrados en su trabajo revelan un complejo diferente para las dos formas de YycF, teniendo menor movilidad electroforética el complejo obtenido con la forma fosforilada del regulador (Ng et al., 2005 y Fig. 54B). En la figura 54C se muestran retrasos en gel realizados por nosotros utilizando la proteína YycF no fosforilada y el mismo fragmento de DNA que dichos

autores y que contiene la región promotora de PcsB, aunque nuestros ensayos se realizaron en presencia de una concentración mas elevada de NaCl para evitar la insolubilización de la proteína. Los resultados obtenidos han confirmado que el RR se une específicamente a la región promotora. En estos ensayos se han utilizado concentraciones más altas de YycF, lo que nos ha permitido observar la formación de dos complejos YycF-DNA. Ya que nuestra proteína está en forma monomérica la presencia de los dos complejos (CI y CII) y el patrón de aparición de ellos sugiere que el CI es el resultado de la unión de un monómero de YycF al DNA, y que el CII es el resultado de la unión cooperativa de dos monómeros de YycF al DNA.

Figura 54. Interacción de la región promotora de PcsB con la proteína YycF. En la figura se muestran los

ensayos de retardo en gel con un fragmento de 228 nt (A) incluyendo la región promotora de PcsB. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando distintas concentraciones de proteína y usando como DNA competidor poli dI-dC. (B) Análisis reproducida de la publicación de Ng y cols. (2005), (C) utilizando YycF purificado por nosotros y usando poli dI-dC como DNA competidor.

Ng y cols. (2005) fosforilaron in vitro la proteína YycF utilizando acetil fosfato como donador. Anteriormente a dicho trabajo, se habían realizaron ensayos de fosforilación no enzimática de la proteína YycF de B. subtilis, siendo todos los intentos fallidos (Blue y Mitchell, 2003). La validación de la fosforilación química de YycF neumocócico fue realizada por Ng y cols. (2005) mediante el análisis de las reacciones por HPLC con una columna C4, al observarse un cambio en el tiempo de elución de la proteína. Nosotros fosforilamos y analizamos la proteína YycF purificada en forma soluble y monomérica (Fig. 46) en las mismas condiciones que el grupo del Dr. Winkler y obtuvimos el mismo tipo de resultado (Fig. 42), que el descrito por estos autores. Este hecho nos indicó que existía fosforilación de YycF. Sin embargo, el análisis por MALDI-TOF de las reacciones de fosforilación reveló que la proteína fosforilada químicamente contenía dos fosfatos (Fig. 45), y además los análisis por ultracentrifugación analítica revelaron que la proteína estaba en forma insoluble. Por ese motivo no realizamos estudios de interacción proteína DNA con YycF fosforilado.

Como ya se ha indicado en la Introducción, YycF es una regulador de respuesta perteneciente a la familia OmpR/PhoB, mostrando sus miembros no sólo estructuras similares tanto en los dominios receptor y efector, sino que también es común en ellos que la forma activa sea dimérica (Bachhawat et al., 2005; Toro-Roman et al., 2005a; Toro-Roman et al., 2005b) . Además, en la mayoría de los RR, incluido PhoB, la fosforilación promueve la formación de dímeros (Mack y Piscataway, 2008). También, la secuencia de la región α4-β5-α5 implicada en la dimerización está altamente conservada en la subfamilia OmpR/PhoB, incluyendo a YycF. Finalmente, se ha obtenido un dímero cristalográfico utilizando el dominio receptor de YycF neumocócico, a una concentración de 10 mg/ml de la proteína (Bent et al., 2004). Por lo tanto, es de esperar que la proteína silvestre YycF conteniendo tanto el dominio efector como receptor, pueda dimerizar. En base a estos antecedentes y a nuestros resultados interpretamos que posiblemente el complejo YycF-P-DNA esté constituido por la unión del dímero al DNA, reconociendo cada motivo hélice-alfa-hélice alada (winged helix) de un monómero un único operador consenso (un hexámero o un heptámero). Además, es factible que la preparación de YycF fosforilado utilizada por el grupo del Dr. Winkler contuviera una concentración de proteína soluble inferior a la utilizada en los ensayos con el regulador no fosforilado monomérico y por ello YycF-P mostraría una aparente menor afinidad por el promotor que la forma no fosforilada.

En S. pyogenes y S. mutans, el SDC YycFG también controla el metabolismo de pared celular, regulando la expresión de homólogos de la proteína PcsB (Senadheera et al., 2005; Liu et al., 2006). En B. subtilis, YycF activa tanto la expresión de yocH, yvcE y lytE, genes codificantes de autolisinas que intervienen en la degradación de la pared celular (Howell et al., 2003), como de ftsAZ, genes implicados en la división celular (Fukuchi et al., 2000; Fukushima et al., 2008). En S. aureus, YycFG también controla el metabolismo de la pared celular, regulando positivamente la expresión de sus dos principales autolisinas, AtlA y LytM (Dubrac et al., 2007). Una función inesperada de las autolisinas es su implicación en la formación de biofilms, debido a que estas enzimas provocan lisis celular, liberando así DNA exógeno que es el mejor componente estructural para el establecimiento inicial y el desarrollo de los biofilms (Spoering y Gilmore, 2006). En S. aureus se ha demostrado que el SDC YycFG controla positivamente la formación de biofilms (Dubrac et al., 2007), al igual que en S. mutans (Senadheera et al., 2005). En S. pneumoniae YycF controla la expresión de LytB y se ha demostrado que alteraciones en esta acetilglucosaminidasa, afectan a la capacidad de esta bacteria para formar biofilms (Moscoso et al., 2006). Además, LytB es la enzima responsable de la separación de las células durante la división celular (De Las Rivas et al., 2002), de forma que mutaciones en esta enzima provocan la formación de largas cadenas neumocócica, que limitan la diseminación de las bacterias durante la infección. Por tanto, se cree que LytB desempeña un papel en la patogénesis, siendo los mutantes deficientes en esta enzima incapaces de colonizar el tracto nasofaríngeo (Gosink et al., 2000). Como YycFG regula positivamente LytB, que es una enzima clave implicada en la división celular y que juega un papel en patogénesis, este SDC puede ser una diana interesante para la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos (Trappetti et al., 2009). Además, alteraciones y delecciones en este SDC provocan la atenuación de la virulencia en infecciones intraperitoneales (Wagner et al., 2002).

Así, los resultados obtenidos en distintas bacterias gram positivas muestran claramente un papel primordial de YycFG tanto en el metabolismo de la pared como en la división celular. En algunas de estas bacterias también afectaría a la formación de biofilms.

En S. pneumoniae la expresión constitutiva de pcsB elimina los requerimientos de regulación positiva del SDC YycFG, y permite la delección del gen yycF (Ng y cols. 2003). Sin embargo, ya que se ha propuesto que es la forma fosforilada de YycF la que es responsable y nuestros experimentos in vivo y los de otros autores sugieren que este

es el caso, una cuestión que quedaría por resolver es porque en S. pneumoniae, a diferencia de otros sistemas bacterianos, YycG no es esencial.

5. El SDC esencial de S. pneumoniae regula la expresión de la biosíntesis