Las células vivas modulan la expresión de sus genes en respuesta a los cambios medioambientales que se producen a su alrededor. Para llevar a cabo esta modulación es necesario un sensor que detecte los cambios químicos o físicos que se han producido, y un regulador que induzca la respuesta a dichos cambios. En las bacterias, los cambios extracelulares son sensados y transducidos dentro de la célula primordialmente por los SDC (Hoch, 2000; Stock et al., 2000; Skerker et al., 2008) (Fig. 2). Estos sistemas están constituidos, generalmente, por dos proteínas, una histidina quinasa (HQ) y un regulador de respuesta. La HQ responde a un determinado estímulo modificando el estado de fosforilación del regulador de respuesta (RR), que provoca la respuesta a dicha señal. La HQ generalmente es una proteína integral de membrana que se autofosforila en un residuo histidina conservado, utilizando como sustrato ATP y que posteriormente transfiere el grupo fosfato a un residuo aminoacídico conservado, generalmente un ácido aspártico. El cambio del estado de fosforilación del RR produce una modificación del dominio efector, que puede provocar: (i) su unión al DNA regulando la transcripción de algunos genes, (ii) realizar actividades enzimáticas, (iii) unirse al RNA o (iv) participar en una interacción proteína-proteína (Gao et al., 2007). Algunas HQ poseen la capacidad de revertir el estado de fosforilación del RR presentando una actividad fosfatasa. Generalmente, la proteína HQ y su correspondiente RR se encuentran codificados por un operón (Stock et al., 2000). Sin embargo, se han encontrado un gran número de miembros RR huérfanos de los SDC en los genomas de los microorganismos. Estos RR se denominan huérfanos porque su SDC carece de la proteína HQ. Por ejemplo, un 57 % de los SDC encontrados en el genoma de Caulobacter crecenteus son huérfanos (Skerker et al., 2005), mientras que en S. pneumoniae solo se ha detectado un RR huérfano (Ulijasz et al., 2004).
Muchos de estos SDC son sistemas sofisticados de señales que se encuentran tanto en eubacterias como arqueas y también se encuentran en algunos organismos eucariotas, tales como levaduras y plantas (Stock et al., 2000). Sin embargo, su abundancia en cada dominio difiere sustancialmente, existiendo diferencias tanto en el
residuo conservado que se autofosforila en la proteína HQ como el grupo conservado al que se transfiere el fosfato. El sistema de fosfotransferencia histidina/aspártico se encuentra en la mayoría de SDC en eubacterias, siendo bastante raro en eucariotas, en los que los dominios de fosforilación predominantes son serina/treonina y tiroxina (Stock et al., 2000). Las señales medioambientales que detectan los SDC son de naturaleza variada, como cambios en la temperatura, la osmolaridad, el pH, la luz, el oxígeno o los nutrientes (Mascher et al., 2006). En las bacterias, el número de SDC depende de las especies, no existiendo ningún SDC en Micoplasma genitalium (Grebe y Stock, 1999) y siendo descritos por ejem. 13 sistemas en S. pneumoniae (Lange et al., 1999), 31 en E. coli (Zhou et al., 2003), y cerca de 30 en Bacillus subtilis (Kobayashi et al., 2001).
Figura 2. Estructura esquemática de un SDC bacteriano. La histidina quinasa es una proteína transmembranal que
contiene un dominio sensor (DS), el dominio de transferencia del fosfato (H) y el dominio catalítico (DC). Una señal específica ambiental induce la autofosforilación de un residuo de histidina (His) localizado en el dominio H y el grupo fosfato es transferido a un aspártico (Asp) situado en el regulador de respuesta, que contiene un dominio receptor (RC) y un dominio efector (DE). La fosforilación del regulador de respuesta puede provocar su unión al DNA.
Existen varias diferencias que distinguen los SDC eucariotas de los procariotas. Las HQ en eucariotas son generalmente proteínas híbridas que contienen además dominios RR de interacción con el DNA, siendo una excepción Arabidopsis ERS (Hua et al., 1995). Sin embargo, es muy infrecuente detectar este tipo de HQ híbridas en
procariotas (5 de 30 HQ en E. coli son híbridas) (Mizuno, 1997). Los RR procariotas contienen, en su mayoría, un dominio de unión al DNA y actúan regulando la transcripción de algunos genes (en el caso de E. coli 25 de los 30 RR cumplen esta condición), mientras que sólo se conoce un caso de RR en eucariotas que contenga un dominio de unión al DNA (el regulador de respuesta SKN7 de Saccharomyces cerevisiae) (Brown et al., 1993). Tanto en procariotas como en eucariotas, el último paso de los SDC es generalmente la regulación de la expresión de determinados genes. En los procariotas la proteína que efectúa este último paso es el RR, mientras que en los eucariotas son otras proteínas reguladas por el SDC las responsables de la respuesta final. Además, existen secuencias específicas que permiten distinguir las proteínas HQ y RR eucariotas de las procariotas (Pao y Saier, 1997).
La HQ y el RR son proteínas modulares que contienen múltiples dominios homólogos y heterólogos. Las HQ han sido clasificadas en dos clases denominadas I y II basándose en la posición dentro de la secuencia del dominio de dimerización con respecto al dominio catalítico (Bilwes et al., 1999). La mayoría de las HQ presentes en las bacterias pertenecen a la Clase I y contienen dos fracciones altamente diferenciadas: la fracción N-terminal altamente variable y la fracción C-terminal altamente conservada. La fracción N-terminal forma el dominio sensor de la proteína, que generalmente es un dominio extracelular, y su variabilidad en secuencia y estructura refleja el amplio espectro de señales que los SDC pueden sensar. La fracción C-terminal es una fracción citoplásmica que presenta la maquinaria catalítica para la autofosforilación y fosfotransferencia. Esta fracción está dividida en dos dominios diferenciados estructuralmente: el dominio de dimerización que contiene la histidina conservada a la que se transfiere el grupo fosfato (dominio H) y el dominio catalítico que une la molécula de ATP (Parkinson y Kofoid, 1992; Dutta y Inouye, 2000) (Fig. 2). Hasta el momento, el único cristal obtenido de la región citoplásmica completa de una proteína histidina quinasa corresponde a la histidina quinasa HQ853 de Thermotoga maritima (Marina et al., 2005). La proteína purificada y posteriormente cristalizada es un homodímero, cuya estructura tridimensional cristalográfica de rayos X se muestra en la Figura 3. Cada monómero de este dímero contiene dos dominios distintos, uno en posición N-terminal que se encuentra formando una horquilla helicoidal y otro C- terminal formado por hélices α/β, estando ambos dominios conectados por una pequeña región. La horquilla helicoidal está formada por dos hélices antiparalelas conectadas a través de nueve residuos. La hélice α1a contiene el residuo conservado de fosforilación
mientras que la hélice α1b contacta con las hélices α2 y α2’ de manera simétrica. El dominio C-terminal está formado por un sándwich α/β, que consiste en una capa de láminas β formada por cinco cadenas (βB, βD-βG) y otra capa compuesta de tres α hélices (α3-α5). Este dominio contiene un par de pequeñas cadenas β antiparalelas (βA y βC) y un puente disulfuro que une el segmento N-terminal de la hélice α3 con la lámina βC. El dominio de unión a ATP (dominio catalítico) es similar en estructura a los dominios quinasas aislados de PhoQ (Marina et al., 2001), CheA (Bilwes et al., 1999), EnvZ (Tanaka et al., 1998) y NtrB (Song et al., 2004) y se encuentra situado entre la lámina βD y la hélice α5. La gran distancia que existe entre el sitio de unión a ATP y la histidina fosfoaceptora sugiere que la región sensora de la HQ debe tener acceso a múltiples cambios conformacionales, de forma que pueda acercarse la región catalítica a la región de dimerización (Marina et al., 2005).
Figura 3. Estructura tridimensional de la región citoplásmica de la HQ de T. maritima. Representación del
dímero cristalográfico HQ853-CD. Las α hélices (α1-α5) están coloreadas en amarillo (subunidad A) y en verde (subunidad B). Las cadenas β (βA-βF) aparecen coloreadas en azul (subunidad A) y rojo (subunidad B). La posición de los extremos C y N terminales está indicada en la subunidad B. El sitio de unión del ATP y el residuo fosfoaceptor (histidina conservada) se encuentran representadas por bolas azules unidas por fragmentos amarillos. Adaptado de Marina y cols. (Marina et al., 2005).
La proteína RR comprende dos dominios, el dominio receptor y el dominio efector (Parkinson y Kofoid, 1992) (Fig. 2). El dominio receptor contiene el aspártico conservado al que se transfiere el grupo fosfato desde la HQ. El dominio efector es el
responsable de la respuesta específica a un determinado estímulo (West y Stock, 2001), al contener el sitio de unión al DNA. Algunas HQ y RR también contienen dominios denominados PAS, que son capaces de sensar el potencial redox (Zhulin et al., 1997; Galperin et al., 2001) o dominios parecidos al SH3 (Bilwes et al., 1999), que media la formación de complejos de proteínas. Los RR pueden clasificarse por homología en sus dominios efectores (Stock et al., 1989) y se subdividen en tres familias denominadas OmpR/PhoB, NarL/FixJ y NrtC/DctD. Los miembros de la familia OmpR/PhoB comprenden aproximadamente el 40 % de todos los reguladores de respuesta y han sido relativamente resistentes a la cristalización. Uno de los primeros miembros que ha sido purificado y cristalizado en forma monomérica es el DrrD de T. maritima (Robinson et al., 2003). En este RR (Fig. 4A), el dominio receptor tiene topología de sandwich α/β, con un cuerpo central de 5 cadenas β paralelas alrededor de dos α hélices en una cara y tres en la otra. La fosforilación tiene lugar en un aspártico altamente conservado (D53) y posicionado en un extremo de la cadena β central (β3) y la transferencia del grupo fosfato al aspártico se promueve por autocatálisis dependiente de magnesio, que está unido cerca del sitio de fosforilación por residuos ácidos conservados.
Figura 4. Estructura molecular del regulador de respuesta DrrD de T. maritima. (A) Representación del
monómero cristalográfico DrrD. Las α hélices están coloreadas en azul. Las cadenas β están coloreadas en rojo. La posición del extremo C (dominio receptor) y N terminal (región efectora) está indicada. El sitio de unión del ATP se encuentra representado por bolas azules (D53). (B) Representación del dominio efector de DrrD. En rosa se muestra la α hélice que interacciona con el surco mayor del DNA. Se puede observar una comparación de los lazos α de diferentes RR de la familia OmpR/PhoB, mostrando que la conformación de estos lazos es bastante flexible. Adaptado de Robinson y cols. (Robinson et al., 2003).
El dominio efector está compuesto por 4 cadenas β antiparalelas seguidas por 3 α hélices y una horquilla de láminas β antiparalelas en el extremo C terminal. La hélice α3 es el lugar de interacción entre los RR de esta familia y el surco mayor del DNA. Entre las hélices α2 y α3 existe un lazo α o lazo de transactivación, existiendo otro lazo entre la hélice α3 y la horquilla de láminas β antiparalelas en el extremo C terminal. Estos lazo de transactivación poseen una estructura flexible (Fig. 4B). La estructura de PhoB/DNA (Blanco et al., 2002) indica que estos lazos flexibles se utilizan para la unión y reconocimiento del DNA y también para la mediación de las asociaciones proteína-proteína. El incremento de la flexibilidad de estas regiones quizá contribuya a su fijación optima a las superficies implicadas en los contactos proteínas-DNA o proteínas-proteínas (Fig. 4B).
Tanto en éste como en otros RR de la familia OmpR/PhoB, las áreas de contacto entre moléculas (monómeros) están mediadas por las regiones α4- β5- α5 del dominio receptor, tal y como se comprobó en el RR RegX3 de Mycobacterium tuberculosis (King-Scott et al., 2007) (Fig. 5).
Figura 5. Estructura molecular del regulador de respuesta RegX3 de Mycobacterium tuberculosis.
Representación del dímero cristalográfico RegX3. Este dímero está formado por dos moléculas, una coloreada de rojo y verde y la otra coloreada de azul y magenta. El dominio receptor de ambas moléculas, representados por verde y magenta, están formados cada uno de ellos, por las láminas β denominadas β1, β2 y β3 y las hélices α denominadas α1, α2 y α3 y al unirse los dos dominios receptores completan la formación de las regiones α4, β5 y α5 de la molécula 1 (roja y verde). Lo mismo ocurre con la molécula 2 (azul y magenta), estando el área de contacto de estas moléculas en estas estructuras (α4, β5 y α5).