Hiperexpresión del SDC esencial de S pneumoniae

Para investigar la función reguladora de YycFG, hemos construido en este trabajo dos plásmidos denominados pRR y pRRHK, que permiten la expresión inducible por maltosa respectivamente de yycF y de yycFG. La influencia de la producción YycF ha sido estudiada en la estirpe capsulada JNR7/87 silvestre y en un mutante isogénico que contiene la inserción yycG::kan con el objeto de evidenciar in vivo las funciones de YycF no fosforilado. Además, el efecto de la sobreproducción de YycF fosforilado ha sido investigado en la estirpe JNR7/87[pRRHK]. Para realizar el estudio se ha realizado una combinación de análisis proteómicos y transcriptómicos en distintas condiciones de inducción con maltosa, analizando así tanto la respuesta temprana como la respuesta adaptativa de S. pneumoniae a cambios en el SDC.

La expresión inducible de yycG y/o yycF a partir de los plásmidos pRRHK o pRR fue detectada en todas las estirpes estudiadas tanto por mediciones de fluorescencia de GFP coexpresada junto con el SDC (Fig. 29 y resultados no mostrado) como por detección de niveles de los transcritos utilizando microarrays (Tablas. S2, S3 y S4). Los resultados obtenidos mostraron que los niveles de expresión dependían del tiempo y condiciones de inducción y eran similares en todas las estirpes analizadas.

La mayoría de las HK de los SDC son proteínas de membrana. Sin embargo, el análisis de la localización celular de YycG de S. pneumoniae (Fig. 6 y resultados no mostrados) reveló que sólo posee una corta región transmembranal de4-12 aminoácidos en su extremo amino terminal. Por ese motivo, con el objeto de determinar la localización de la HK en forma activa en la estirpe JNR7/87[pRRHK] se realizaron ensayos de autofosforilación tanto de la fracción correspondiente a las vesículas de membrana como de la fracción citosólica de extractos protéicos totales. Se detectó una banda cuya masa molecular corresponde a la de la proteína YycG, tan sólo en la fracción de membrana de cultivos portadores de pRRHK (Fig. 37A). Estos resultados indicaron que la hiperexpresión del gen yycG provoca la síntesis de niveles elevados de YycG capaz de insertarse en la membrana de S. pneumoniae en forma activa y

funcional. La predicción de la localización celular de la proteína YycF indica que es una proteína citosólica. Así, como era de esperar el análisis de los extractos protéicos de la estirpe portadora del plásmido pRRHK, mediante hibridación de western con anticuerpos desarrollados frente a YycF, reveló la presencia mayoritaria de la proteína en la fracción citosólica en niveles muy superiores a los detectados en la estirpe control (Fig. 37B). Además, también fue detectada YycF en la fracción de membrana. Este hecho podría ser debido a un atrapamiento de proteínas citosólicas en las vesículas membranosas durante la preparación de ellas. Sin embargo, el análisis en geles 2D de preparaciones de membranas linearizadas (Fig. 51) mostró la presencia de la proteína YycF en los extractos de todas las estirpes estudiadas, siendo muy superior sus niveles en aquellas en las que el gen yycF estaba sobrexpresado. Estos resultados indican que una fracción de YycF puede estar unida a membrana quizás durante su interacción con YycG durante el proceso de su fosforilación o con otras HK, ya que se ha mostrado in vitro la fosforilación del regulador por la HK de especies enterocócicas (Wagner y cols. 2002) o en su interacción con proteínas auxiliares del SDC. Apoyando la segunda hipótesis, la esencialidad de YycF y no de YycG sugiere que el RR puede actuar independientemente de su HK, posiblemente participando en la transducción de señal con otras proteínas neumocócicas. Estudios recientes han revelado que los SDC a menudo incluyen varias proteínas auxiliares que tienen efectos regulatorios sobre YycFG (Szurmant y cols. 2007). Un candidato, es la proteína VicX con motivos de unión a zinc HxHxD de función desconocida. Su gen codificante vicX (también denominado yycJ) ha sido identificado en todos los operones YycFG de bacterias gram positivas. Además, en S. pneumoniae VicX es requerido para el crecimiento bacteriano sólo cuando los niveles de YycF están reducidos y la expresión constitutiva de vicX atenúa los defectos de los mutantes neumocócicos carentes de yycG (Throup y cols. 2000; Ng y cols. 2003).

Por otra parte, el análisis proteómico en geles bidimensionales de extractos protéicos totales de las estirpes portadoras de los plásmidos pRR (Fig. 34) o pRRHK (Fig. 38) teñidos con SyproRubi reveló la existencia de dos manchas protéicas que fueron identificadas como la proteína YycF por análisis de MALDI-TOF de sus digeridos trípticos. El polipéptido mas abundante (RR) mostraba un pI de 4,71, mientras que el polipéptido minoritario (RR*) poseía un pI de 4,78. Inicialmente propusimos que RR* podría ser la forma fosforilada de YycF y que el fosfato unido al regulador sería el responsable de la modificación de su punto isoeléctrico (Mohedano et al. 2005). Sin

embargo, la movilidad relativa de RR* y RR en geles 2D también indicaba la existencia de diferencia en la masa molecular de los polipéptidos, siendo su valor estimado de 24,3 kDa para RR (la masa molecular esperada para YycF) y de 23,2 kDa para RR*. El análisis de MALDI-TOF del digerido tríptico de RR* confirmo que carece de la región carboxilo terminal de YycF, mostrando este resultado que el polipéptido es un fragmento proteolítico del RR. Los niveles detectados de RR* en las distintas estirpes analizadas y sobreproductoras de YycF fueron similares, indicando una posible proteolisis específica producida in vivo o durante la preparación de los extractos. Sin embargo, la posible funcionalidad de RR*, si existe, es desconocida en la actualidad.

Figura 51. Detección de YycF en preparaciones de membranas linearizadas. En la figura se muestran los niveles

relativos de YycF en las distintas estirpes analizadas determinados por cuantificación de las manchas proteicas después de su fraccionamiento en geles 2D.