Electroforesis capilar

La electroforesis está basada en el proceso de migración de especies cargadas sometidas a la acción de un campo eléctrico9. Este campo eléctrico se produce a través de una fuente de alimentación y se aplica a una disolución electrolito. La separación de los analitos se basa en la diferente carga y tamaño de los mismos.

El medio que se utiliza o disolución electrolito debe evitar la formación de corrientes por convección creadas por gradientes de densidad, concentración, etc. que limitarían la separación. Sin embargo, el uso de medios anticonvectivos, tipo geles, crea una resistencia al movimiento resultando un análisis excesivamente largo. La forma de solucionar este problema es reducir al máximo el espacio. Por esta razón se utilizan capilares, de una longitud comprendida entre 75 y 125 cm y de 25 a 100 µm de diámetro, que anulan la convección. Los extremos del capilar están sumergidos en la disolución electrolito juntamente con los electrodos, que conectados a la fuente de alimentación, proporcionan un potencial de 100 a 500 V/cm que suponen del orden de 10 a 30 kV. De esta manera se consigue una migración rápida de las especies. En principio, al aplicar el potencial, las especies cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo y las cargadas negativamente lo harán hacia el ánodo.

La velocidad con la que una especie migra está determinada por la expresión:

E

v=µ_ep∗ ( I-2 )

siendo µep la movilidad electroforética característica de cada especie en cada medio y E la intensidad del campo eléctrico. Inicialmente, es un movimiento uniformemente acelerado, basado en la fuerza aplicada por el campo eléctrico tal que:

E q

F = ∗ ( I-3 )

donde q es la carga de la especie.

En contraposición a esta fuerza, aparece una fuerza de rozamiento con la superficie del capilar que aumenta con la velocidad de migración hasta que ambas fuerzas se igualan y la velocidad se hace constante:

v r F_r =−6∗π∗ ∗η∗ ( I-4 ) Si F = F_r ⇒ E r q v ∗ ∗ ∗ ∗ = η π 6 ( I-5 ) y r q ep ∗ ∗ ∗ = η π µ 6 1 ( I-6 )

siendo r el radio de la especie, η la viscosidad y v la velocidad de la especie. Así pues, la migración de una especie viene fijada por su relación q/r.

15 Paralelamente al flujo electroforético, existe el flujo electroosmótico, que es un flujo de la disolución electrolito originada por la ionización de la pared interna del capilar. El capilar suele ser de vidrio o sílice, por lo que existen grupos silanoles terminales que están en contacto con la disolución y que a pH básico pueden disociarse creando cargas negativas. En algunos casos, estas cargas negativas provienen de la adsorción de iones del electrolito en la pared del capilar. Las cargas negativas atraen a los iones positivos formando una capa de cationes fijados a la pared del capilar. Esta primera capa no es suficientemente densa para neutralizar la carga negativa, por lo que se crea una segunda capa de cationes que, al estar mas alejada de la pared del capilar es móvil. Ambas capas forman una doble capa difusa de cationes. Por tanto, al aplicar el potencial, esta capa móvil de cationes se desplazará hacia el cátodo y, al estar solvatados, empujará a la disolución hacia el cátodo.

El flujo electroosmótico viene determinado por una diferencia de potencial creada por esta ordenación de cargas positivas creada dentro del capilar. Este potencial se denomina potencial zeta:

ε µ η π

ζ ₌ 4∗ ∗ ∗ EOF _{( I-7 )}

Teniendo en cuenta las anteriores definiciones, la velocidad del flujo electroosmótico se expresa como:

E vEOF ∗ ∗ ∗ ∗ = η π ζ ε 4 ( I-8 )

y, teniendo en cuenta la relación II-2, la movilidad electroosmótica en la disolución viene dada por:

η π ζ ε µ ∗ ∗ ∗ = 4 EOF ( I-9 )

Mientras que la movilidad electroforética en un medio no puede modificarse, la movilidad electroosmótica puede variar por muchos factores como el pH, la fuerza iónica, la concentración de tampón, la temperatura, modificadores orgánicos, etc.. Así, se define la movilidad aparente para una especie como:

EOF ep

ap µ µ

De esta manera, con un flujo electroosmótico elevado, se puede conseguir que todas las especies, tanto catiónicas como neutras o aniónicas, se dirijan hacia el cátodo, poco antes del cual, hay una ventana en el capilar que permite su detección. El detector que se utiliza suele ser un espectrofotómetro UV-VIS. La detección se puede realizar de manera directa o indirecta. Es decir, si el analito absorbe en esta zona del espectro, se realizará una medida directa; en el caso de que el analito sea transparente, la medida será indirecta. En este último caso, debe ser la disolución electrolito la que sea coloreada. Así pues, la medida se realiza por una disminución de la señal observada.

Para el análisis de aniones es habitual realizar un cambio en la polaridad de los electrodos de manera que las especies migren hacia el ánodo. De esta manera se evita que los cationes y especies neutras lleguen a la ventana del detector antes que los aniones, alargando de manera innecesaria el tiempo de análisis. En la Figura I—5 se puede observar un esquema de este proceso:

Figura I—5: Esquema básico del proceso de electroforesis capilar

Las condiciones fijadas para la medición del ion cloruro se dan en la Tabla I-4:

17 Tabla I-4: Condiciones de análisis por electroforesis capilar del cloruro

Tipo de capilar Sílice fundida Diámetro interno del capilar (mm) 0,075 Diámetro externo del capilar (mm) 0,360

Longitud del capilar (cm) 60 (50 hasta el detector) Potencia aplicada (kV) 30 (polaridad inversa)

Tiempo de separación (min) 5

Tipo de detector U.V. (posibilidad de diode array) Longitud de onda del detector (nm) 270 y 372

Disolución electrolito utilizada 2 mM de DETA+2 mM de K2Cr2O7

Como se observa en la tabla, el tiempo de separación es de 5 minutos. En realidad, el ion cloruro, con estas condiciones experimentales, llega al detector en tiempos entre 3,2 y 3,5 minutos. Por otra parte, se han utilizado dos longitudes de onda diferentes debido a que el equipo utilizado permite esta posibilidad. De esta manera, si la matriz de las muestras que se analizan absorbieran también en una de las longitudes de onda fijadas, se puede realizar la medida con la otra longitud de onda. En nuestro caso, la disolución matriz no afectaba a ninguna de las dos medidas, por lo que el valor que se ha tomado ha sido una media de ambas. Por último, la disolución electrolito permite la detección indirecta de las muestras, ya que es una disolución que absorbe en el ultravioleta.