ENSAYO DE ACUMULO

La metodología empleada para realizar los experimentos de acumulo fue diferente de los de Silva y colaboradores 2000, conforme se encuentra descrito en materiales y métodos. En los experimentos de Silva y colaboradores, las células eran cultivadas inicialmente en 200 mL de CN, después de esto eran centrifugadas y lavadas con solución de sales para remover residuos del CN, después de este procedimiento, 100 mL del cultivo eran centrifugados y toda la masa seca celular era inoculada en 50 ml de medio mineral libre de nitrógeno, conteniendo glucosa (5 g/L) y propionato (1 g/L). En estas condiciones de ensayo, apenas el acumulo era favorecido. Así mismo, Silva y colaboradores no realizaron experimentos cuantitativos para verificar se los clones capaces de restituir el fenotipo prp+ también restituían la eficiencia original de la cepa salvaje para transformar el propionato a unidades 3HV (Y3HV/Prp=0,10 g/g). Así, los ensayos propuestos en este trabajo presentaban dos diferencias de procedimiento: los medios eran inoculados a partir de caldo nutriente con kanamicina (CNK) directamente en medio mineral con nitrógeno y exceso de fuente de carbono (glucosa) para que crecieran y, al agotarse el nitrógeno, era adicionado el propionato para entonces realizarse el acumulo de PHA por los clones validados. Esto debería demandar menos manipulación y menos riesgo de contaminación. Otra diferencia es que, para la manutención del Pvk100 con el respectivo inserto complementador de los mutantes, hubo la necesidad de la adición de antibiótico. Así en las condiciones testadas, se observaron notables diferencias en el comportamiento de las cepas, debido a que los mutantes complementados y la cepa salvaje complementada, no presentaron un buen crecimiento pasadas las 24 horas de cultivo en medio CNK, por ende se va a ver reflejado en una disminución del acumulo del polímero, así mismo este hecho puede ser explicado por la presencia del plásmido, ya que los mutantes y la cepa salvaje que no contenían el plásmido presentaban un buen crecimiento, notado así por la turbidez observada en el medio. Éste mismo hecho fue observado en los ensayos realizados en placas de agar cuando se realizaron ensayos de complementación, donde las cepas testadas demoraron 7 días para crecer en MM. Es importante aclarar que éste medio no contiene factores de crecimiento que estimulen el rápido desarrollo de las cepas

en él semeadas. Por otro lado, los experimentos de determinación de PHA no evidenciaran la presencia de unidades 3HV en el polímero producido.

A partir de los resultados obtenidos en el ensayo, se pueden proponer repeticiones del mismo, debido a la necesidad evidente de ajustes para obtenerse resultados confiables según lo esperado inicialmente, pues por literatura consultada, se esperaba obtener un rendimiento superior de los mutantes al ser comparados con la cepa salvaje. Así mismo, al comparar los mutantes complementados con la cepa salvaje, éstos presentaron un menor rendimiento y no tan cercano al rendimiento esperado.

A partir de los resultados obtenidos en el ensayo, se pueden proponer repeticiones del mismo, debido a la necesidad evidente de ajustes para obtenerse resultados confiables según lo esperado inicialmente, pues por literatura consultada, se esperaba obtener un rendimiento superior de los mutantes al ser comparados con la cepa salvaje. Así mismo, al comparar los mutantes complementados con la cepa salvaje, éstos presentaron un menor rendimiento y no tan cercano al rendimiento esperado. Entre los ajustes propuestos está la reducción de la concentración de antibiótico a ser empleada y la realización de test de tiempo necesario para llegar a necesidades celulares más altas hasta el agotamiento de la fuente de nitrógeno. Una posibilidad es el aumento del tiempo de incubación inicial, antes de adicionarse el propionato destinado al acumulo y la introducción de mas de un control que seria la cepa salvaje conteniendo el cósmido pVK100 sin ningún inserto. La ausencia de unidades 3HV en el polímero final puede indicar la necesidad de ajustes que podrían ser la reducción de propionato adicionado, o la adición después de que las culturas tuviesen una mayor densidad.

7

CONCLUSIONES

Se realizó la validación de la biblioteca genómica de Burkholderia sacchari, observando que es una buena representación del genoma.

Se corroboró la agrupación de los mutantes LFM 183, 184, 185, 186 y 198, por medio de ensayos fenotípicos, generando subgrupos de acuerdo al consumo de ácido acrílico. Se obtuvieron los clones P1 y P2 de la biblioteca genómica de B. sacchari, capaces de restituir la capacidad de crecimiento en propionato a los mutantes en estudio.

Se validó cuantitativamente el grado de complementación por medio de ensayos de acumulo a los mutantes complementados, evidenciando un menor crecimiento comparado con la cepa salvaje y con los mutantes, así mismo presentaron una menor producción de HV que la cepa salvaje.

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Anexo 1

Principales vías descritas para el catabolismo de ácido propiónico (Textor et al., 1997): a) alfa-oxidación, b) beta-oxidación, c) alfa-carboxilación, d) carbocilación reductiva y e-g) condensación de Claisen.