UTILIZACIÓN DE MICROORGANISMOS RECOMBINANTES INCAPACEZ DE

INCAPACEZ DE CRECER EN ÁCIDO PROPIÓNICO.

El ácido propiónico es adicionado como co-substrato precursor de unidades de 3HV en la producción del co-polímero, sin embargo, solamente una pequeña fracción de éste es incorporada de esta forma al polímero, siendo que el restante es desviado para otras rutas metabólicas, como crecimiento celular y formación de unidades 3HB. (Squio & Falcão, 2003).

Como el acido propiónico o propionato de sodio son más caros que mas otras fuentes de carbono que pueden ser consumidas por los microorganismos durante la fermentación,

Lee et al, desenvolvieron a partir de A.eutrophus NCIMB 11599, una cepa mutante de A.eutrophus BK-23, que es incapaz de asimilar el acido propiónico para el crecimiento celular. Las dos cepas fueron comparadas en cuanto a la habilidad de acumular P(3HB- co-3HV) y a la composición del polímero producido. Los experimentos fueron realizado en cultivo alimentado, utilizando la ración de alimentación P/G de 0.21 y limitación en nitrógeno. Niveles finales similares de contenido de células y del co-polímero fueron obtenidos para los cultivos, entretanto, se observó que para la cepa mutante, una fracción de unidades 3HV dos veces mayor (22 mol%), en cuanto para la cepa original fue menor que 10 mol%. La tasa de conversión de ácido propiónico en unidades 3HV durante la fase de acumulo fue de 0.4 gHV/g ac proppara el mutante, contra 0.1 gHV/g ac

prop para la cepa original. Así, los autores relatan que con esa cepa se torna posible producir P(3HB-co-3HV) con mayor fracción de unidades 3HV, usando menos ácido propiónico.

En estudios semejantes, Sartori (1998) obtuvo una cepa mutantes A. eutrophus UV1, derivada de R. eutropha DSM 545, incapaz de crecer en propionato, visando su mejor aprovechamiento para la biosíntesis de las unidades 3HV del polímero. La cepa mutante UV1 acumuló 37 mol% de 3HV, en cuanto a la cepa original acumuló a penas 8.6 mol% y se mostró capaz de convertir 60.7% de todo el propionato suministrado a unidades 3HV, siendo que, en las mismas condiciones, la cepa original sólo convirtió 18.5%. Más allá de eso, la cepa mutante todavía mantiene, o hasta supera, la capacidad de producción de polímero total de la cepa original. De esta forma, el nuevo mutante es presentado como un óptimo potencial de aprovechamiento industrial.

Otro microorganismo que está siendo estudiado para la producción de PHA´s es

Burkholderia sp. Burkholderia sp. LFM 101 es presentada como una buena productora del polímero, entre tanto, la conversión de acido propiónico en unidades 3HV es restricta a menos de 10% del rendimiento máximo teórico, que es de 1.35g 3HV/g ácido propiónico de acuerdo con Gómez et al (1996). La intención de aumentar esta eficiencia de conversión y utilización del ácido propiónico, Silva et al, desenvolvieron mutantes de

Burkholderia sp. LFM 101 incapaces de crecer en ácido propiónico, todavía capaces de acumular unidades de 3HV del ácido. El mutante Burkholderia sp. LFM 189 y la cepa

original fueron comparadas creciendo en un biorreactor con raciones de ácido propiónico y sacarosa (P/S) de 0.44 para la cepa original y de 0.09 para el mutante, ya que era esperado que el mutante tuviese mejor utilización del ácido propiónico. Con el mutante LFM 189 obtuvieron una alta tasa de conversión del ácido propiónico en unidades de 3HV, de 1.2 gHV/g ac.prop, en cuanto para la cepa original obtuvieron apenas

0.05 gHV/g ac.prop. Entre tanto, las células acumularon poco polímero, siendo cerca del 50%

para la bacteria LFM 189 y 65% para la LFM 101. Loa autores sugieren que la elucidación de los mecanismos de de crecimiento del acumulo de PHA en la cepa mutante puede llevar a nuevos rumbos para garantizar la reducción de costos en la producción de P(3HB-co- HV) usando este mutante y aplicando estrategias adecuadas de cultivo.

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JUSTIFICACIÓN

La mayoría de los plásticos producidos durante décadas son de origen petroquímico, es decir, de fuentes naturales no renovables, que por el acelerado crecimiento urbano y la necesidad de consumo han ido agotando rápidamente dicha materia prima. Esto ha generando en la población y especialmente en los investigadores un interés particular por hallar soluciones rápidas y concretas de fuentes naturales y por ende, de organismos capaces de solucionar el problema ambiental que están generando los plásticos producidos a partir de petróleo, ya que la degradación de éstos se lleva a cabo en un tiempo mayor a 100 años (Duarte, 2004).

Por lo anteriormente mencionado, en la actualidad, se están desarrollando diversas investigaciones que conllevan a la producción de plástico a partir de materias primas renovables, que minimizan el consumo de petróleo y por ser fabricadas a partir de fuentes naturales, son fácilmente degradadas y producidas.

Debido a los altos costos de éste plástico, a la participación mínima en el mercado internacional y a las dificultades de procesamiento, se están buscando cepas altamente eficientes en la conversión de sustratos en el producto deseado, así como en el desarrollo de procesos que permitan explorar al máximo el potencial de dichas cepas y del desenvolvimiento de procesos extracción-purificación, de forma que los costos sean reducidos drásticamente. (Franchetti, 2006)

Actualmente se produce plástico biodegradable a partir de la sacarosa obtenida del bagazo de caña (materia prima que es ampliamente cultivada en suelo Brasilero), utilizando microorganismos que acumulan intracelularmente el polímero PHA como B. sacchari, a partir del cual es producido plástico. Por los antecedentes mencionados, día a día se busca investigar nuevas fuentes de carbono que permitan acrecentar el rendimiento teórico de producción de polímero, disminuyendo así costos de producción y por ende del producto, haciéndolo accesible al público en general, así como incrementando sus diferentes usos.

Según antecedentes bibliográficos, se están desarrollando metodologías que investigan la utilización de sacarosa con propionato como fuente de carbono, para obtener un plástico mucho más maleable y de fácil degradación por diferentes organismos, que conllevan a la disminución del impacto ambiental. Por ende es de gran importancia restablecer el fenotipo de los mutantes LFM 183, 184, 185, 186 y 198, conocer los genes afectados, restituyendo la expresión de los intermediarios de la vía de la α-oxidación, con el fin de alcanzar un rendimiento teórico cercano al de la cepa salvaje, es decir, de 0,10 g/g.

Una vez obtenido el fragmento que restituyó el fenotipo salvaje a éstos mutantes, debe ser validada la complementación integral por medio de experimentos en frascos agitados. Si esto se lleva a cabo, quiere decir que los fragmentos contienen genes relacionados en el catabolismo de propionato en éstos mutantes afectados en el uso de intermediarios de la α-oxidación. Siendo así, los fragmentos de DNA con esta propiedad constituyen una importante herramienta para investigar en trabajos posteriores si existe la vía en cuestión e propones nuevos experimentos para mejorar aún más la formación de 3HV.

Dentro de esta fase observada en la literatura está siendo realizado el presente trabajo, cuyos objetivos se encuentran a seguir.

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OBJETIVOS