Ensayos cinéticos para la determinación de la fidelidad de copia

3.9.1 Ensayos cinéticos en el estado estacionario

3.9.1.1 Incorporación de dNTPs correctos o incorrectos

Estos ensayos se basan en la determinación de los parámetros cinéticos para la incorporación de dNTPs correctos e incorrectos sobre un complejo molde-iniciador correctamente apareado. Se determinaron constantes cinéticas para las RTs BH10, BH10_V75A, BH10_V75F, BH10_V75I, BH10_V75L, BH10_V75M, BH10_V75S y BH10_V75T en ensayos de incorporación de nucleótidos correctos y para BH10, BH10_V75A, BH10_V75F y BH10_V75I en ensayos de incorporación de nucleótidos incorrectos. Se utilizó el complejo D2-47/PG5-25, siendo el nucleótido correcto dTTP y los incorrectos dCTP, dGTP y dATP. Los ensayos se llevaron a cabo en 10 μl de un tampón HEPES 50 mM, pH 7,0, que contenía acetato magnésico 15 mM, NaCl 15 mM, acetato potásico 130 mM, DTT 1 mM y polietilénglicol 6000 al 5%. La concentración de enzima activa en el ensayo fue de alrededor de 6-10 nM, y la concentración del complejo molde-iniciador fue de 30 nM.

La reacción se inició mediante la incubación de la mezcla con la enzima y el complejo molde-iniciador durante 10 min a 37ºC en ausencia de nucleótidos, seguida de la adición de los nucleótidos apropiados en concentraciones crecientes. Las mezclas se incubaron durante un tiempo de 10 a 40 s para los nucleótidos correctos y

de hasta 60 min para los nucleótidos incorrectos. Las reacciones se detuvieron añadiendo 4 μl de solución de parada, incubándose luego las muestras durante 10 min a 90ºC. Los productos de reacción se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 20% conteniendo urea 8 M.

Los geles se analizaron siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.5. Los porcentajes de iniciador elongado en un nucleótido obtenidos a las distintas concentraciones de dNTPs, se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten, determinándose la constante catalítica, kcat, y la constante de Michaelis aparente, Km,

para cada enzima y el correspondiente nucleótido. Así, se obtuvo una estimación de la fidelidad de copia de la RT, comparando la eficacia catalítica (kcat/Km) obtenida para los

nucleótidos incorrectos respecto a la obtenida para el nucleótido correcto. La eficiencia de incorporación de nucleótidos erróneos (finc) se define como:

finc = [kcat/Km (nucleótido incorrecto)] / [kcat/Km (nucleótido correcto)]

3.9.1.2 Elongación de extremos desapareados

Este ensayo se basa en la determinación de los parámetros cinéticos para la incorporación del nucleótido correcto sobre un complejo molde-iniciador que presenta el extremo 3’ del iniciador desapareado. Se analizaron las RTs BH10, BH10_V75A, BH10_V75F y BH10_V75I. Se compararon los parámetros cinéticos obtenidos para la incorporación de dTTP (nucleótido correcto) con los complejos, D2-47/PG5-25C, D2- 47/PG5-25G y D2-47/PG5-25A (Figura 15) con los obtenidos para la incorporación de dTTP con el complejo correctamente apareado (D2-47/PG5-25) (apartado 3.9.1.1). El procedimiento para preparar complejos con extremos desapareados es el mismo que el seguido con complejos correctamente apareados (apartado 3.4).

El ensayo se realizó en las condiciones descritas en el apartado 3.9.1.1, utilizándose las mismas concentraciones de enzima activa y de complejos molde- iniciador. Después de añadir concentraciones crecientes de dTTP a una mezcla, preincubada a 37ºC, de la enzima y el molde-iniciador, las reacciones se detuvieron pasados 20 s para las elongaciones del extremo A:C y después de 15-40 min para las extensiones de los extremos A:G y A:A. El procesamiento de las muestras y el análisis de los datos fueron idénticos a los establecidos en el apartado 3.9.1.1. En este caso se

pudo obtener una estimación de la capacidad de la enzima para extender extremos desapareados (fext), aplicando la fórmula:

fext = [kcat/Km (híbrido con extremo 3’ desapareado)] / [kcat/Km (híbrido con

extremo 3’ apareado)]

3.9.2 Ensayos cinéticos en el estado pre-estacionario

3.9.2.1 Incorporación de dNTPs correctos

Con este método se determinaron los parámetros cinéticos en el estado pre- estacionario, para la incorporación de un nucleótido correcto en un complejo molde- iniciador correctamente apareado, para las enzimas BH10, BH10_V75A, BH10_V75F y BH10_V75I. Se utilizó el complejo molde-iniciador 31T/21P siendo dTTP el nucleótido correcto incorporado. La obtención del complejo 31T/21P se ha descrito en el apartado 3.4. Los ensayos se realizaron utilizando un aparato de “Quench Flow” modelo QFM- 400 (Bio-Logic Science Instruments).

Los ensayos se llevaron a cabo mezclando 12 μl del tampón de reacción (Tris- HCl 50 mM pH 8,0, KCl 50 mM y Triton X-100 al 0,05%), conteniendo enzima activa a una concentración de 50 nM y complejo molde-iniciador a 100 nM, con 12 μl del mismo tampón de reacción conteniendo concentraciones crecientes de dTTP en presencia de 12 mM de MgCl2.

Las reacciones se pararon con 12 μl de EDTA 0,9 M a diferentes tiempos en un intervalo comprendido entre 25 y 6000 ms, incubándose a continuación las muestras durante 10 min a 90ºC. Los productos de la reacción se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 20 % conteniendo urea 8 M. Los resultados se analizaron utilizando placas fotosensibles y un analizador de imagen BAS1500 (Fujifilm), tal como se ha detallado previamente (apartado 3.5).

La cantidad de iniciador elongado ([P]), obtenido a lo largo de los diferentes tiempos de reacción se ajustó a la ecuación:

donde A es la amplitud, kobs es la constante aparente de formación del enlace

fosfodiéster y kss es la tasa de recambio de la enzima, esto es, la constante cinética de

la fase linear del estado estacionario.

La dependencia de la kobs con la concentración de dNTP viene dada por la

ecuación hiperbólica:

kobs = kpol x [dNTP]/(Kd + [dNTP]) (Ecuación 2)

donde kpol y Kd son las constantes catalítica y de afinidad para la incorporación del

dNTP respectivamente. Estas constantes se determinaron usando el programa Sigma Plot 2001 (Systat Software, Inc.).

3.9.2.2 Incorporación de dNTPs incorrectos

Estos ensayos se basan en la determinación de los parámetros cinéticos en el estado pre-estacionario, para la incorporación de dNTPs incorrectos sobre un complejo molde-iniciador correctamente apareado. Se utilizó el complejo molde- iniciador 31T/21P, siendo los nucleótidos incorrectos dCTP y dGTP. Se analizaron las RTs BH10, BH10_V75A, BH10_V75F y BH10_V75I. Los ensayos se llevaron a cabo manualmente en 40 μl de tampón de reacción (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, KCl 50 mM y Triton X-100 al 0,05%). La concentración de enzima activa en el ensayo fue de 120 nM, y la concentración del complejo 31T/21P fue de 100 nM.

A una mezcla preincubada durante 10 min a 37ºC de la enzima y el complejo molde-iniciador se le añadió tampón de reacción conteniendo concentraciones crecientes del nucleótido apropiado y una concentración de MgCl2 entre 12 y 24 mM.

Tras incubar a 37ºC durante 5-600 s, la reacción se detuvo añadiendo 4 μl de solución de parada e incubando la muestra durante 10 min a 90ºC. Los productos de la reacción se resolvieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 20% conteniendo urea 8 M. El análisis de los datos se llevó a cabo de la misma manera que en el apartado 3.9.2.1.

Los porcentajes de iniciador elongado ([P]) obtenidos a los diferentes tiempos de reacción se ajustaron a la ecuación:

donde A y kobs serían la amplitud y la constante aparente de formación del enlace

fosfodiesterse respectivamente. En las condiciones utilizadas en este ensayo, la concentración de enzima es mayor que la del complejo molde-iniciador, por lo que se elimina la influencia de la tasa de recambio de la enzima (kss), que podría interferir en

las determinaciones de constantes cinéticas obtenidas a baja velocidad de incorporación.

La determinación de Kd y kpol para cada enzima y el correspondiente nucleótido

se llevó a cabo usando la ecuación 2 del apartado 3.9.2.1. De esta manera, se obtuvo una estimación de la fidelidad de copia de la RT comparando los parámetros cinéticos obtenidos con los nucleótidos incorrectos respecto a los obtenidos con el nucleótido correcto. La eficiencia de incorporación de nucleótidos erróneos se define como:

finc = [kpol/Kd (nucleótido incorrecto)] / [kpol/Kd (nucleótido correcto)]

3.9.2.3 Extensión de extremos desapareados

Con estos ensayos se llevó a cabo la determinación de los parámetros cinéticos en el estado pre-estacionario para la incorporación del nucleótido correcto sobre un complejo molde-iniciador con el extremo 3’ del iniciador desapareado. Se analizaron las RTs BH10, BH10_V75A, BH10_V75F y BH10_V75I. Se compararon los parámetros cinéticos obtenidos para los complejos 31T/21PT, 31T/21PG y 31T/21PA (Figura 15), con los obtenidos con el complejo 31T/21P (apartado 3.9.2.1), para la incorporación de un nucleótido correcto (dTTP).

Estos ensayos se llevaron a cabo usando el aparato de “Quench Flow” modelo QFM-400 o bien manualmente cuando los tiempos de reacción fueron mayores de 8 s. La concentración de enzima activa en el ensayo fue de 120 nM, y la concentración del complejo molde-iniciador fue de 100 nM. Las reacciones se llevaron a cabo de la manera descrita en los apartados 3.9.2.1 y 3.9.2.2., según la metodología utilizada. El procesamiento de las muestras y el análisis de los datos fueron idénticos a lo establecido en el apartado 3.9.2.2. En este caso, se pudo obtener una estimación de la capacidad de la enzima para extender extremos desapareados (fext), aplicando la

fórmula:

fext = [kpol/Kd (híbrido con extremo 3’ desapareado)] / [kpol/Kd (híbrido con

3.10 Ensayos genéticos para la determinación de la fidelidad de