CI 50 (µM) para el siguiente nucleótido complementario a
4.3 Análisis del efecto de mutaciones en la posición 75 sobre la fidelidad de copia de la RT del VIH-
4.3.2 Extensión de iniciadores en ausencia de un dNTP
Este tipo de ensayos permite medir de forma cualitativa los efectos de las mutaciones introducidas en la posición 75 sobre la incorporación de nucleótidos incorrectos y su posterior extensión durante la síntesis de DNA.
El ensayo se realizó usando dos complejos molde-iniciador diferentes: M54/3TRP (Figura 30) y D2-47/PG5-25 (Figura 31) a una concentración de 30 nM, y las enzimas RT BH10 y todos los mutantes en la posición 75.
En la Figura 30 se muestran los resultados obtenidos cuando se usó como complejo molde-iniciador M54/3TRP. Todas las RTs analizadas fueron capaces de llevar a cabo extensiones totales en presencia de los cuatro dNTPs. Las enzimas BH10_V75L, BH10_V75M y BH10_V75S presentaron un patrón de bandas muy similar al de la enzima BH10. En cambio, se observaron algunas diferencias con los mutantes BH10_V75A, BH10_V75F, BH10_V75I y BH10_V75T. Por ejemplo, en las reacciones llevadas a cabo en ausencia de dGTP (pocillos –G) los productos obtenidos con los mutantes BH10_V75F, BH10_V75I y BH10_V75T fueron ligeramente más cortos que los obtenidos con la enzima BH10. Por el contrario, el mutante BH10_V75A presentó productos ligeramente más largos tanto en ausencia de este nucleótido como en ausencia de dATP (pocillo -A) (ver flechas en la Figura 30).
Por otro lado, en la reacción catalizada por el mutante BH10_V75I, en ausencia de dATP (pocillo -A), se observó una acumulación de producto en la posición +1 bastante mayor que la observada para la RT BH10 (ver flechas en la Figura 30). La reacción realizada por la RT BH10_V75F en ausencia de dTTP mostró al cabo de 5 min una acumulación de producto principalmente en la posición +5, a diferencia de la RT BH10, que en las mismas condiciones, acumula el producto en la posición +8.
Puesto que no se observaron grandes diferencias entre los mutantes y la RT BH10 en las extensiones del iniciador 3TRP, para confirmar los resultados anteriores se llevó a cabo el mismo experimento en un contexto de secuencia diferente. Se utilizó
para ello el complejo molde-iniciador D2-47/PG5-25. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 31. Tanto los mutantes como la RT BH10 fueron capaces de extender totalmente el iniciador cuando todos los dNTPs requeridos estaban presentes en la reacción. Ya que el molde carece de citosina en su secuencia sólo fueron necesarios tres dNTPs (dATP + dCTP + dTTP) para conseguir extensiones totales. El patrón de bandas observado para los mutantes BH10_V75L, BH10_V75M y BH10_V75S fue muy similar al obtenido con la RT BH10. Sin embargo, fue algo distinto para los mutantes BH10_V75A, BH10_V75F, BH10_V75I y BH10_V75T.
BH10 BH10_V75A
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
5 min 15 min 30 min 60 min
BH10_V75F BH10_V75I BH10_V75L BH10_V75M BH10_V75S BH10_V75T P - F - +5 - +8 - P - F -
Figura 30. Extensión de iniciador 3TRP por la RT BH10 y los mutantes en la posición Val-75. Estos ensayos se llevaron a cabo utilizando un molde de DNA (M54) y en ausencia de un dNTP complementario. Con un asterisco (*) se indican los pocillos en los que la mezcla de dNTPs contiene los 4 nucleótidos. Las columnas marcadas con -G, -A, -C y -T indican la ausencia de ese nucleótido en la mezcla. Se tomaron alícuotas tras 5, 15, 30 y 60 min de reacción. P y F indican la posición del iniciador de 22 nucleótidos de longitud sin elongar y de la extensión total de 54 nucleótidos, respectivamente. Las bandas destacadas en las posiciones +5 y +8 representan las paradas después de la incorporación de 5 y 8 nucleótidos, respectivamente. Las flechas se usan para indicar paradas específicas de los mutantes en la Val-75. Las cajas se usan para destacar diferencias entre la RT BH10 y el mutante BH10_V75F
En las reacciones realizadas en ausencia de dATP, cuando la enzima utilizada fue BH10_V75A, se observó una acumulación de iniciador totalmente elongado mayor
que para la RT BH10, particularmente después de incubar a tiempos largos (comparar las intensidades de las bandas en la posición +7 para el mutante BH10_V75A y la enzima BH10). Por el contrario, cuando las reacciones se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones pero en presencia de los mutantes BH10_V75F, BH10_V75I y BH10_V75T los productos obtenidos fueron más cortos. En las reacciones catalizadas por el mutante BH10_V75F, la acumulación de productos totalmente elongados fue más lenta que en las catalizadas por la RT BH10 (flechas en la Figura31). Este mismo efecto se observó con los mutantes BH10_V75I y BH10_V75T, aunque en este caso la diferencia mayor se observó al comparar las intensidades de las bandas +4 y +7 a los tiempos más cortos (5 y 15 min).
* -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T 5 min 15 min 30 min 60 min 5 min 15 min 30 min 60 min 5 min 15 min 30 min 60 min 5 min 15 min 30 min 60 min
* -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T 5 min 15 min 30 min 60 min
* -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T 5 min 15 min 30 min 60 min
* -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T 5 min 15 min 30 min 60 min
* -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T * -A -C -T 5 min 15 min 30 min 60 min
BH10 BH10_V75A P - BH10_V75F BH10_V75M BH10_V75L BH10_V75I BH10_V75T BH10_V75S F - +4 - +7 - P - F - +4 - +7 -
Figura 31. Extensión de iniciador PG5-25 por la RT BH10 y los mutantes en la posición Val-75. Estos ensayos se llevaron a cabo utilizando un molde de DNA (D2-47) y en ausencia de un dNTP complementario. Con un asterisco (*) se indican los pocillos en los que se incluyen los 3 nucleótidos necesarios para la extensión total. Las columnas marcadas con -A, -C y -T indican la ausencia de ese nucleótido en la mezcla. Se tomaron alícuotas tras 5, 15, 30 y 60 min de reacción. P y F indican la posición del iniciador de 25 nucleótidos de longitud sin elongar y de la extensión total de 47 nucleótidos, respectivamente. Las bandas destacadas en las posiciones +4 y +7 representan las paradas después de la incorporación de 4 y 7 nucleótidos, respectivamente. Las flechas se usan para indicar paradas específicas de los mutantes en la Val-75. Las cajas se usan para destacar diferencias entre la RT BH10 y los mutantes BH10_V75I y BH10_V75T.
Estos resultados sugieren que los mutantes BH10_V75F, BH10_V75I y BH10_V75T podrían se más fieles que la RT BH10, mientras que BH10_V75A conferiría una fidelidad de copia reducida.
4.3.2.1 Efecto de Be2+ y Mn2+ sobre la fidelidad de copia de la RT del VIH-1
Se cree que todas las DNA polimerasas utilizan dos cationes metálicos para llevar a cabo la reacción de polimerización. Estos dos iones metálicos situados en el centro activo de las polimerasas, se encuentran a una distancia aproximada de 4 Å. Posiblemente el metal catalítico (metal A) esté implicado en la reacción nucleofílica, mientras que el metal de unión al nucleótido (metal B) coordine el grupo trifosfato del dNTP entrante y facilite la disociación del PPi. Aunque el Mg2+ sea el catión divalente
más utilizado por la mayoría de las polimerasas para llevar a cabo la catálisis in vivo, las DNA polimerasas son capaces de utilizar otros cationes divalentes, principalmente el Mn2+. Sin embargo, se sabe que cationes divalentes como Mn2+, Ni2+, Co2+ y Be2+
alteran la selectividad de nucleótido y la fidelidad de copia en reacciones catalizadas por DNA polimerasas (Sirover y Loeb 1976; Beckman et al., 1985; Snow et al., 1993; Sabbioni et al., 1999; Cases-González et al., 2000).
Para analizar el efecto de los cationes divalentes, Mn2+ y Be2+ sobre la fidelidad de copia de la RT del VIH-1, se realizaron ensayos de extensión de iniciadores en presencia de tres dNTPs. Con estos ensayos se obtuvo una idea cualitativa de los efectos que producen estos cationes divalentes en la fidelidad de esta polimerasa. Se utilizó para ello el complejo molde-iniciador M54/3TRP y las enzimas BH10 y BH10_V75I.
Recientemente se han publicado estudios de dinámica molecular que han demostrado que la presencia del Mg2+ catalítico (sitio A) es crítica para que la distancia
entre el OH del extremo 3’ del iniciador y el oxígeno no enlazante del fosfato α del dNTP entrante sea adecuada para que tenga lugar el ataque nucleofílico (Figura 32)
(Mendieta et al., 2007). Además, mediante ensayos cinéticos en estado pre-
estacionario, se confirmó que el Mg2+ catalítico (sitio A) es necesario para que se
forme un complejo catalíticamente competente. Sin embargo, el Be2+ presentó un
efecto dual, a bajas concentraciones de Be2+ la RT aumenta su eficacia catalítica,
mientras que a altas concentraciones éste compite con el Mg2+ en la unión al sitio A provocando la inhibición de la actividad DNA polimerasa de la RT (Mendieta et al.,
2007). Por esta razón es necesaria la presencia de Mg2+ en el medio, cuando se utiliza
Be2+ como cofactor.
dTTP/Be2+(B);Be2+(A)
dTTP/Be2+(B);Mg2+(A)
dTTP/Mg2+(B);Be2+(A)
dTTP/Mg2+(B);Mg2+(A)
Figura 33. Vista detallada del centro activo de la RT del VIH-1 en complejos ternarios simulados, que contienen Mg2+ y/o Be2+ en los sitios A, B o ambos. Se muestran las distancias interatómicas entre el O del extremo 3’ del iniciador y el fósforo α del dTTP entrante. Esta figura ha sido adaptada de Mendieta et al. (2007).
Tanto en presencia de Mn2+ como de Be2+ las RTs analizadas fueron capaces
de llevar a cabo extensiones totales en presencia de los cuatro dNTPs. En las reacciones llevadas a cabo en presencia de Mn2+ se observó que los productos, tanto
con la RT BH10 como con el mutante BH10_V75I, fueron más cortos en ausencia de dTTP (-T). Por el contrario, en ausencia de dATP (-A) la acumulación de productos totalmente elongados fue más rápida que cuando las reacciones fueron llevadas a cabo en presencia de Mg2+, para las dos RTs analizadas. Sin embargo, en las
reacciones catalizadas por el mutante BH10_V75I, se observaron diferencias respecto a la RT BH10. Así, los productos obtenidos en ausencia de dCTP (-C) eran significativamente más cortos en las reacciones llevadas a cabo con BH10_V75I en presencia de Mn2+ (Figura 33), lo que apoya la hipótesis de que la mutación V75I
Mg2+ (2mM) Mg2+(2mM) + Be2+ (2mM) Mn2+ (2mM) A) BH10
B) BH10_V75I
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
15 min 30 min 60 min 15 min 30 min 60 min 15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
15 min 30 min 60 min
* -G -A -C -T * -G -A -C -T * -G -A -C -T
15 min 30 min 60 min
Mg2+ (2mM) Mg2+(2mM) + Be2+ (2mM) Mn2+ (2mM) F -
P-
F -
P-
Figura 33. Extensión del iniciador 3TRP por la RT BH10 (A) y el mutante BH10_V75I (B), en presencia de Mg2+,
Be2+ o Mn2+. Estos ensayos se llevaron a cabo utilizando un molde de DNA (M54), en ausencia de un dNTP complementario. Con un asterisco (*) se indican los pocillos en los que la mezcla de dNTPs contiene los 4 nucleótidos. Las columnas marcadas con -G, -A, -C y -T indican la ausencia de ese nucleótido en la mezcla. Se tomaron alícuotas tras 15, 30 y 60 min de reacción. P y F indican la posición del iniciador de 22 nucleótidos de longitud y la del producto resultante de la extensión total de 54 nucleótidos, respectivamente.
En las reacciones llevadas a cabo con la RT BH10 en presencia de Be2+, se
observaron productos más cortos tanto en ausencia de dGTP (-G) como de dATP (-A) en todos los tiempos analizados. Cuando la enzima que catalizaba la reacción era BH10_V75I el efecto fue similar (Figura 33). Estos resultados nos indican que el Be2+
podría aumentar la fidelidad de copia de la RT del VIH-1.