Purificación de RTs

La purificación de las enzimas con los cambios introducidos se llevó a cabo por dos métodos diferentes: bien mediante la expresión individual de las dos subunidades de la RT (p66 y p51), o bien mediante la expresión de la subunidad p66, que posteriormente fue procesada por la proteasa del VIH-1 para dar lugar a la formación del heterodímero p66/p51.

3.3.1. Purificación mediante expresión individual de las dos subunidades

de la RT

3.3.1.1. Expresión de las subunidades p66 y p51 de la RT

Ambas subunidades fueron expresadas por separado, creciéndose de forma independiente las bacterias portadoras de los plásmidos pRT6 y pT51H (Figura 13A) de la siguiente manera:

Expresión constitutiva de p66: Se prepararon 3 matraces Erlenmeyer conteniendo cada uno de ellos 1 litro de medio LB (bactotriptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l y NaCl 10 g/l) con ampicilina a 100 μg/ml, que se inocularon con 10-20 μl de un cultivo reciente de bacterias E. coli DH5α portadoras del plásmido pRT6.

Expresión inducible de p51: Se inocularon 20 ml de medio LB/ampicilina (100 μg/ml) con una pequeña alícuota de un cultivo reciente de bacterias E. coli DH5α, portadoras del plásmido pT51H.

Ambos cultivos se crecieron durante la noche a 37°C en agitación constante. Pasado este tiempo, se inocularon 200 ml de medio LB/ampicilina (100 μg/ml) con 20 ml del cultivo crecido de bacterias portadoras de pT51H, y se dejó crecer hasta alcanzar una absorbancia a 600 nm de 0,8-1,0. Se indujo entonces la expresión de p51 añadiendo isopropil-β-D-tio-galactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,6 mM. Al cabo de 60 min a 37°C, se combinó este cultivo con los crecidos durante la noche y en los que se expresa constitutivamente p66, y se recogieron las células por centrifugación a 3000 rpm durante 30 min a 4°C en un rotor GS3 (Sorvall).

3.3.1.2 Lisis de las bacterias y formación del heterodímero

Las bacterias se resuspendieron en 100 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,8 conteniendo NaCl 0,3 M, y se incubaron a 4°C durante 5 min en presencia de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y lisozima 0,2 mg/ml. A continuación, se añadieron 40 ml de un tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,8, conteniendo NaCl 4 M para favorecer la disociación de posibles homodímeros p66/p66 y p51/p51. El extracto se sonicó a máxima potencia durante 5-8 min. Tras esta etapa, se eliminaron precipitados mediante centrifugación a 10000 rpm durante 15 min a 4°C en un rotor

SS-34 (Sorvall) y se incubó el sobrenadante a 37°C durante 30 min. Se favoreció la formación de los heterodímeros p66/p51 incubando la mezcla a 4°C durante 15 min. La disolución obtenida se centrifugó de nuevo en las condiciones anteriores. A continuación, se le añadió al sobrenadante tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,8 conteniendo NaCl 0,3 M, en cantidad suficiente como para disminuir la concentración de NaCl por debajo de 0,4 M. Posteriormente, se filtró la muestra a través de papel Whatman MM y se guardó a 4°C hasta su purificación por cromatografía de afinidad.

3.3.1.3 Cromatografía de afinidad

La muestra se aplicó en una columna de 1,5-2 ml de Ni2+_{-ácido nitriloacético-}

agarosa (ProBondTM_{, Invitrogen) previamente equilibrada en tampón fosfato sódico 50}

mM, pH 7,8, conteniendo NaCl 0,3 M. A continuación, se lavó la columna con 100 ml del tampón de equilibrado, con 60 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,0, que contenía NaCl 0,5 M y con 50 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,0, conteniendo NaCl 0,5 M e imidazol 50 mM.

Tras los lavados, la RT se eluyó de la columna con un gradiente preparado con 20 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,0, conteniendo NaCl 0,5 M e imidazol 50 mM y 20 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,0, que contenía NaCl 0,5 M e imidazol 0,5 M. Se recogieron fracciones de 2 ml y se analizaron alícuotas de 150 μl de cada fracción mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS (10-12% acrilamida). Las fracciones enriquecidas en las subunidades p66 y p51 se reunieron y dializaron frente a un tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 25 mM, etilendiaminotetraacetato sódico (EDTA) 1 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10% (tampón de diálisis estándar), utilizándose bolsas de diálisis de tipo Visking 20/32 de diámetro 16 mm (Serva).

3.3.1.4 Cromatografía de intercambio iónico

El contenido de la bolsa de diálisis se aplicó en su totalidad en una columna de aproximadamente 0,3 ml de Q-Sepharosa (GE Healthcare), previamente equilibrada en el tampón de diálisis estándar. A continuación, se equilibró una columna de 2 ml de Bio-Rex 70 (Bio-Rad) en el tampón de diálisis estándar y se aplicó la fracción no retenida de la columna anterior.

La columna de Bio-Rex 70 se lavó con 20 ml de tampón de diálisis estándar, eluyéndose la RT con un gradiente preparado con 25 ml de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 25 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10% y con 25 ml de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 0,6 M, EDTA 1 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10%. Se recogieron fracciones de 2 ml y se analizaron alícuotas de distintas fracciones mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida y SDS (10-12% acrilamida). Las fracciones en las que se observaron las bandas de p66 y p51, características de la RT, se reunieron y dializaron frente al tampón de diálisis.

Tras varios cambios del medio de diálisis, el contenido de la bolsa (15-25 ml aproximadamente) se concentró hasta un volumen inferior a 0,5 ml mediante centrifugación a 4°C en ciclos de 20 min, utilizando concentradores de tipo Centriprep- 30 y Centricon-30 (Amicon) y siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las preparaciones concentradas de RT se almacenaron a -20°C.

3.3.1.5 Comprobación de la pureza y la concentración de la enzima obtenida

La determinación de la pureza de la proteína obtenida se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS (Laemmli, 1970). La concentración de proteína se determinó utilizando como patrón seroalbúmina bovina (BSA).

3.3.2 Purificación de RTs mediante la expresión de la subunidad p66 y

su posterior procesamiento.

3.3.2.1. Expresión de la subunidad p66 de la RT

Se inocularon 10 μl de un cultivo reciente de bacterias E. coli XL1-Blue PR portadoras de los plásmidos pRT66B (Figura 13B) y pATPR (Figura 13C) en 20 ml de medio LB con ampicilina (100 μg/ml) y kanamicina (50 μg/ml). Este cultivo se dejó toda la noche a 37ºC en agitación constante. Los 20 ml de cultivo se añadieron a 300 ml de LB que contenía ampicilina (100 μg/ml) y kanamicina (50 μg/ml) y se continuó la incubación a 37ºC durante 4 horas más. Pasado este tiempo, se prepararon 3 matraces que contenían 1 litro de medio LB/ampicilina (100 μg/ml)/kanamicina (50 μg/ml), y a cada uno de ellos se le añadieron 100 ml del cultivo anterior. Una vez alcanzada la densidad óptica a 600 nm de 0,6-0,8, se añadió IPTG a una concentración final de 0,6 mM y se mantuvo la incubación a 37ºC durante 24 horas.

Pasado este tiempo se recogieron las células por centrifugación a 3000 rpm durante 30 min a 4°C, utilizando un rotor GS3 (Sorvall).

3.3.2.2 Lisis de las bacterias

Cada gramo de células se resuspendió en 2 ml de tampón Tris/HCl 40 mM pH 8,0 conteniendo EDTA 25 mM, sacarosa al 10%, PMSF 1 mM, benzamidina 2 mM y lisozima 1 mg/ml. Después de una incubación a 4ºC en agitación constante durante 15 min se añadió el mismo volumen de un tampón que contenía NP-40 al 0,8%, DTT 20 mM, PMSF 1 mM y benzamidina 2 mM y se volvió a incubar 15 min en agitación a 4ºC. Pasado este tiempo se añadió NaCl a una concentración final de 0,5 M y se sonicó la muestra durante 1 min. A continuación, dicha muestra se centrifugó a 15000 rpm durante 15 min a 4°C, utilizando un rotor SS-34 (Sorvall). El sobrenadante se diluyó 7 veces con tampón fosfato sódico 50 mM pH 6,8 y se guardó a 4ºC hasta su purificación.

3.3.2.3 Cromatografía de intercambio iónico

En primer lugar se preparó la columna de celulosa fosfato (Whatman) según las indicaciones del fabricante y se equilibró con tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,8 hasta que se alcanzó un pH de 6,0. Una vez equilibrada la columna, se pasó la muestra y se lavó con 10 volúmenes de tampón fosfato sódico 50 mM pH 6,8.

Finalmente, la enzima se eluyó con un gradiente preparado con 25 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, que contenía NaCl 30 mM, y con 25 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, que contenía NaCl 1 M. Se recogieron fracciones de 2 ml, se midió su absorbancia a 280 nm y se analizó una muestra de cada fracción en un gel de poliacrilamida y SDS (10-12 % acrilamida) para detectar las dos subunidades: p66 y p51. Se juntaron aquellas fracciones en las que se encontró proteína y en las cuales la proporción de ambas subunidades era de aproximadamente 1:1.

3.3.2.4 Cromatografía de afinidad

La muestra obtenida de la columna anterior se aplicó en una columna de 1,5-2 ml de Ni2+_{-ácido nitriloacético-agarosa (ProBond}TM_{, Invitrogen) previamente equilibrada}

columna y la elución de la proteína se llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento que en el apartado 3.3.1.3.

Se recogieron fracciones de 2 ml y se analizaron alícuotas de 15 μl de cada fracción mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS (10-12 % acrilamida). Las fracciones enriquecidas en las subunidades p66 y p51 se reunieron y dializaron frente al tampón de diálisis estándar, utilizándose bolsas de diálisis de tipo Visking 20/32 de diámetro 16 mm (Serva).

Tras cuatro cambios del medio de diálisis, la muestra (15-25 ml aproximadamente) se concentró hasta un volumen inferior a 1 ml mediante centrifugación a 4°C en ciclos de 20 min, utilizando concentradores de tipo Centriprep- 30 y Centricon-30 (Amicon), y siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las preparaciones concentradas de RT se almacenaron a -20°C.

3.3.2.5 Comprobación de la pureza y la concentración de la enzima obtenida

La determinación de la pureza de la proteína obtenida se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS. La concentración de proteína se determinó en base al coeficiente de extinción molar a 280 nm (ε280= 260450 M-1 cm-1)

de la RT (Kati et al., 1992).