Ensayos de actividad in vitro con proteína recombinante

disponible en el laboratorio. Para los experimentos de unión, se acoplaron covalentemente a chips CM4 (Biacore, GE Healthcare) entre 1.000 y 3.000 unidades de resonancia (RUs) de las proteínas purificadas en una de las celdas del chip, la otra celda se utilizó como control de unión inespecífica. Las citoquinas recombinantes humanas y murinas se inyectaron a una concentración de 100 nM en tampón HBS-EP (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% (v/v), surfactante P20, pH 7,4), a un flujo de 10 µl/min durante 3 min. Se monitorizaron tanto la asociación como la disociación. Después de cada inyección, la superficie del chip se regeneró con 10 mM glicina-HCl, pH 2,0 durante 1 min.

Para la determinación de las afinidades, las proteínas recombinantes purificadas se acoplaron covalentemente mediante aminas a baja densidad (500 RUs) a chips CM4 en una de las dos celdas del chip, la otra celda se utilizó como control de unión inespecífica. Se comprobó que los chips tenían una capacidad de unión máxima menor o igual a 200 RUs y se inyectaron distintas concentraciones de los ligandos (TNFSFLs y CKs) en tampón HBS-EP a un flujo de 30 µl/min durante 2 min y se siguió la disociación durante 5 min. Después de cada inyección, la superficie del chip se regeneró inyectando 10 mM glicina-HCl pH 2,0 durante 1 min. En todos los casos se restó la respuesta media de una inyección de tampón HBS-EP para eliminar los posibles artefactos del sistema. Los sensorgramas obtenidos se analizaron globalmente mediante el programa informático Biaevaluation 3.2 (GE Healthcare), normalizándolos y ajustándolos al modelo de unión 1:1 de Langmuir.

Para los ensayos de competición, previamente a la inyección, el analito se incubó en hielo durante 15 min con el posible competidor a la relación molar indicada en cada caso.

3.7.2 Geles Nativos

Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes, se observó la formación de complejos de gran tamaño, al incubar la proteína recombinante con sus posibles ligandos. Se incubó 1 µg de la proteína purificada de baculovirus con TNFα y/o CKs a 4ºC durante 30 min en un volumen final de 6 µl. Para estos experimentos se utilizó un tampón PBS sin BSA para resuspender las citoquinas. Como sistema de electroforesis, se utilizó el sistema PhastSystem de GE Healthcare y geles homogéneos prefabricados al 12,5% de poliacrilamida (PhastGel homogeneous 12.5, GE Healthcare) acondicionados con Native Buffer Strips (GE Healthcare) (Katcher y cols., 1992). Se cargaron 4 µl por pocillo de cada muestra y tras la electroforesis, realizada según las recomendaciones del fabricante, se procedió a teñir el gel con azul de Coomassie.

3.8 Ensayos de actividad in vitro con proteína

recombinante

Para confirmar in vitro las uniones detectadas para las proteínas recombinantes expresadas en baculovirus y purificadas, se llevaron a cabo diversos experimentos que se pusieron a punto para abarcar todas las posibles características inmunomoduladoras de las proteínas caracterizadas en esta tesis.

3.8.1 Ensayos de citotoxicidad con TNFSFLs solubles

Para valorar la actividad in vitro de los vTNFRs y las distintas construcciones de CrmD, se llevaron a cabo experimentos de citotoxicidad en células L929, una línea de fibroblastos de ratón, siguiendo un protocolo puesto a punto en el laboratorio (Alejo y cols., 2006). Para ello, se incubaron las distintas citoquinas citotóxicas, a diferentes concentraciones, en ausencia o presencia de cantidades crecientes de proteína recombinante. Tras 1 h de incubación a 37ºC en DMEM suplementado con 2% FBS, se añadió la mezcla sobre células L929 sembradas el día anterior en placas de 96 pocillos (M96) a 10.000 células/pocillo. Para acelerar el efecto citotóxico de la citoquina empleada en cada caso, se añadió a las células el inhibidor de la transcripción, actinomicina D (Sigma), a una concentración final de 4 µg/ml.

Tras 18 h de incubación, se midió la viabilidad celular añadiendo 20 µl por pocillo de Cell Titter AQueous One

Solution (Promega) y determinando la absorbancia a 492 nm en un lector de placas Sunrise (Tecan). El

porcentaje de la viabilidad celular se representó como el cociente entre la absorbancia de las muestras con proteína recombinante y citoquina (muestra problema) y la de los pocillos sin citoquina (viabilidad máxima). Previamente, se sustrajo de todos los datos el valor de absorbancia tomado en ausencia de protección. (pocillos que sólo contenían citoquina, viabilidad mínima)

3.8.2 Ensayo de citotoxicidad con tmTNFα

Para comprobar si CrmD, sus mutantes puntuales y los otros vTNFRs eran capaces de interferir con la función como ligando del tmTNFα, se realizaron experimentos de citotoxicidad utilizando células RAW264.7 como células efectoras y células L929 como diana, adaptando un protocolo descrito por Zheng y cols. (Zheng y cols., 2009). Las células RAW264.7 se estimularon con 500 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) derivado de la cepa de Escherichia Coli 026:B6 (Sigma), lo cual indujo la expresión de tmTNFα (Yoon y cols., 2007). A las 6 h, se recogieron las células y, tras lavarlas con PBS para retirar el sTNFα, se procedió a su fijación con paraformaldehído (PFA) al 1% durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron a 0,5 x 106 _{células/ml en DMEM suplementado con 2% de FCS.}

Estas células fijadas se incubaron con concentraciones crecientes de CrmD y otras proteínas recombinantes durante 1 h a RT en agitación rotatoria. Tras este tiempo, las células RAW264.7 (efector) se añadieron sobre células L929 (diana) sembradas el día anterior en placas M96 a 10.000 células/pocillo, a una relación efector:diana de 5:1 y en un volumen final de 100 µl.

Al igual que en los ensayos de citotoxicidad con sTNFα, se añadió sobre las células actinomicina D a 4 µg/ml para favorecer el efecto del tmTNFα. Después de 18 h de incubación a 37º C, se calculó nuevamente la viabilidad celular con 20 µl/pocillo de Cell Titter AQueous One Solution (Promega) y midiendo la absorbancia a 492 nm. El porcentaje de viabilidad se expresó como el cociente de absorbancias entre las muestras problema y los pocillos en los que no se añadieron células RAW 264.7 (viabilidad máxima). El valor de absorbancia de la supervivencia mínima (muestras sin proteína recombinante) se restó de todos los datos previamente.

3.8.3 Ensayos de señalización reversa mediada por tmTNFα

Se incubaron macrófagos de ratón, RAW 264.7, durante 30 min con cantidades crecientes de proteína recombinante en 50 µl de DMEM suplementado con 2,5% de FCS. Tras ese tiempo, se dieron 3 lavados con medio fresco, para después incubar las células durante dos h más en 100µl de DMEM suplementado con 2,5% FCS. Se recogieron los sobrenadantes y se analizó por triplicado, la presencia de sTNFα de ratón mediante el kit de ELISA, mTNFα Ready Set Go (EBioScience) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

3.8.4 Ensayos de quimiotaxis

Con el objetivo de evaluar la capacidad anti-CK de CrmD y otras proteínas recombinantes, se realizaron experimentos de inhibición de la migración inducida por CKs en transwell (Zaballos y cols., 1999).

Se evaluaron varias CKs distintas y para cada caso se utilizaron células que, por expresar el receptor correspondiente, eran capaces de migrar hacia una CK concreta. Así, se tomaron células MOLT4 para la migración con mCCL25 (70 nM), células MonoMac1 con mCXCL12β (20 nM), o A20 con mCCL27 (125 nM). Para la migración inducida por mCXCL13 (100 nM) se extrajeron esplenocitos de ratones BALB/c. Para ello, bazos extraídos de ratones se disgregaron sobre una malla de 70 µm de poro utilizando coladores de células (BD Bioscience). Se lavaron las mallas con medio RPMI fresco sin FCS y se centrifugaron las células a 1.500 rpm durante 5 min. Para lisar los eritrocitos, se realizó un choque hipotónico con agua estéril durante 10 segundos. Se detuvo la lisis añadiendo 0,5 ml de NaCl 0,1M y se lavaron las células con medio RPMI suplementado con 0,1% de FCS, medio en el que se mantuvieron las células durante 4 h antes del experimento.

El día del ensayo con las líneas celulares A20, MOLT4 y MonoMac 1, se recogieron las células en crecimiento exponencial y, tras lavarlas con PBS, se resuspendieron a 10 x 106 _{células/ml en RPMI}

suplementado con 0,1% de FCS. Para estos ensayos se utilizaron placas M96 en transwell (Neuroprobe). En los pocillos inferiores se incubó la CK en ausencia o presencia de cantidades crecientes de proteína purificada en RPMI suplementado con 0,1% FCS, a 37ºC durante 30 min. Se colocó la membrana sobre la placa y se repartieron 25µl de la suspensión de células en cada uno de los compartimentos superiores. Tras 3-4 h de migración a 37 ºC, se lavaron las células restantes de los compartimentos superiores con PBS y se centrifugaron las placas dos min a 1.000 rpm antes de retirar la membrana. Se cuantificó el número de células que atravesaron la membrana hacia los pocillos inferiores donde se encontraba la CK añadiendo 5 µl/pocillo de Cell Titter AQueous One Solution (Promega) y midiendo la absorbancia a 492 nm. Los resultados se representaron como el porcentaje en relación a la migración en ausencia de proteína recombinante. Los datos se normalizaron previamente con la absorbancia en ausencia de CK.