Inhibición de la actividad de los TNFSFLs por CrmD

4.1.3.1 CrmD inhibe la unión del TNFα a su receptor celular pero no la de

APRIL

La alta afinidad de CrmD por TNFα sugiere que su interacción podría competir la unión del TNFα a su receptor celular, una interacción que se da con una afinidad de 0,35-1,23 nM (Reed y cols., 1997). Se comprobó esta hipótesis mediante un ensayo de SPR con un chip CM4 acoplado con 1.000 RUs de la proteína mTNFR2Fc purificada de baculovirus. Esta proteína contiene la región extracelular del receptor celular mTNFR2, fusionada a una porción Fc humana. Se preincubó mTNFα (50 nM) en HBS-EP, durante 15 min en hielo, en ausencia o presencia de un exceso molar de 10 veces de CrmD (500 nM). Posteriormente, se inyectaron las mezclas sobre el chip de mTNFR2. Como se observa en la Figura 16A, CrmD bloqueó completamente la unión del mTNFα a su receptor. Así, se concluyó que la unión de CrmD a mTNFα inhibe eficazmente la interacción mTNFα-mTNFR2.

APRIL (TNFSFL13) es una citoquina implicada en la supervivencia, diferenciación y activación de linfocitos (Furuya y cols., 2011). Se ha descrito que es capaz de estimular la proliferación de ciertas líneas celulares in

vitro (Hahne y cols., 1998). Sin embargo, estos experimentos tienen el problema de ser poco reproducibles y

de requerir el uso de una forma de APRIL de alta actividad específica (Dillon y cols., 2006). Además todos estos ensayos se han puesto a punto con la forma humana de APRIL (hAPRIL), una citoquina que CrmD no une (Tabla 6). Se intentaron poner a punto experimentos de proliferación celular inducida por mAPRIL con distintas líneas celulares (Jurkat, NIH-3T3, A20), pero no se consiguió una estimulación del crecimiento celular suficiente para poder evaluar un posible efecto anti-APRIL de CrmD.

Para valorar esta supuesta actividad de CrmD, se decidió abordar el problema mediante un experimento de competición por SPR. Brevemente, se inyectó mAPRIL (40nM) en ausencia o presencia de CrmD o su receptor celular BCMA en solución, sobre un chip CM4 acoplado con BCMA. CrmD a 2 µM, a diferencia de BCMA soluble, fue incapaz de evitar o reducir en grado alguno la unión de mAPRIL a su receptor (Figura 16B), por ello se concluyó que la unión de mAPRIL a CrmD no parece tener relevancia biológica.

Respecto a la posible interacción de CrmD con LIGHT, no se consiguió poner a punto ningún experimento para poder confirmar la actividad anti-mLIGHT de CrmD. LIGHT es una citoquina de membrana que interacciona con los receptores HVEM y LTβR (Ware, 2009), funcionando como una importante molécula coestimuladora de linfocitos e induciendo la expresión de CKs y otros factores proinflamatorios (Zou y cols., 2007). Se intentó establecer un ensayo de competición mediante SPR con CrmD de la unión de LIGHT a HVEM y LTβR, pero no se pudo detectar unión de un mLIGHT (R&D) soluble a ninguno de sus receptores celulares, con lo que tampoco se pudo realizar un ensayo de competición con CrmD similar a los anteriores.

A B

A

Figura 16. CrmD compite la unión de TNFα a su receptor pero no la de APRIL. A) Sensorgramas de union a un chip CM4 acoplado con mTNFR2, de 50 nM mTNFα en HBS-EP en ausencia (azul) y presencia de 500 nM (1:10) de CrmD (verde). B) El receptor celular de mAPRIL, mBCMA se acopló por aminas a un chip CM4. Sobre este chip, se inyectaron 40 nM de mAPRIL en ausencia (azul) o presencia de una cantidad equimolar de mBCMA soluble (40 nM) (rojo) ó 2 µM (1:50) de CrmD (azul) en HBS−EP y se registraron los sensorgramas de union en cada caso a 10 µl/min. Con triángulos invertidos se indican el inicio y el fin de la inyección. -100 -50 0 50 100 150 200 -50 -10 30 70 110 150 190 230 270 310 350 RU s mApril 40nM mApril-CrmD (1:50) mApril-BCMA (1:1) mBCMA -50 0 50 100 150 200 250 300 350 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 s mTNF 50nM mTNF 50nM-CrmD (1:10) mTNFR2 RU

4.1.3.2 CrmD inhibe la citotoxicidad mediada por TNFα, LTα y LTβ

Hasta ahora se ha demostrado que CrmD es capaz de interaccionar con algunos TNFSFLs. Más aún, los experimentos de competición mediante SPR demostraron que la unión de TNFα por CrmD bloquea la interacción de esta citoquina con su receptor celular, lo que potencialmente inhibiría los efectos del TNFα. TNFα (TNFSFL2), LTα (TNFSFL1) y LTβ (TNFSFL3) poseen actividad citotóxica in vitro en líneas celulares susceptibles como L929. Así, se plantearon una serie de experimentos con los que demostrar que CrmD era capaz de inhibir la función citotóxica de estas citoquinas. La LTα se compone de tres subunidades α mientras que la LTβ es un heterotrímero αβ que puede presentar dos (TNFSFL3A) o una (TNFSFL3B) subunidades β. Por lo tanto, se dispuso de un total de cuatro posibles ligandos citotóxicos de CrmD.

Al añadir estas cuatro citoquinas preincubadas con cantidades crecientes de CrmD, se consiguió bloquear de manera dosis dependiente la muerte celular inducida por la citoquina (Figura 17). Sin embargo, CrmD no bloqueó el efecto citotóxico de TRAIL (TNFSFL10), una citoquina que por SPR no se unió a CrmD (Figura 14). De acuerdo con una peor afinidad por LTα2β1 (KD= 100 nM), CrmD presentó un bajo efecto de

inhibición de la muerte celular inducida por esta citoquina, llegando únicamente a un 15% de protección a la concentración probada más elevada (120 nM). Estos datos confirmaron, no sólo que CrmD une TNFα, LTα y LTβ, sino que además inhibe los efectos biológicos de estas citoquinas sobre sus receptores.

4.1.3.3 CrmD inhibe la migración inducida por CCL25, CCL27 y CXCL13, pero

no la de CXCL12β

Con el fin de comprobar la actividad anti-CK de CrmD se llevaron a cabo experimentos de migración en

transwell. En estos experimentos, un tipo celular específico que expresa el receptor para la CK en estudio

migra a través de una membrana hacia un compartimento inferior en el que se ha preincubado la CK con cantidades crecientes de CrmD a las dosis indicadas en cada caso. La limitación de este experimento es precisamente encontrar un par CK-célula que funcione de manera significativa y consistente. Por ello, de las CKs unidas por CrmD sólo se consiguió poner a punto un experimento para cuatro de ellas: mCCL25, mCXCL12β, mCCL27 y mCXCL13.

Figura 17. CrmD inhibe el efecto citotóxico de mLTα, mTNFα, mLTα1β2 y en mucho menor medida de mLTα2β1. Se preincubó CrmD a crecientes relaciones molares (1:5, 1:10 y 1:50), con las distintas citoquinas utilizadas a concentraciones de entre 5 y 10 veces su dosis específica 50 (ED50), mLTα (40 nM), mTNFα (1,2 nM), mLTα1β2 (22 nM), mLTα2β1(2,2nM) y mTRAIL (2,5 nM). La mezcla se añadió junto con 4 µg/ml de actinomicina D a células L929 y a las 16h se estimó la supervivencia celular. Cada muestra se analizó por tiplicado y se representan, junto con sus desviaciones estándard, las medias del porcentaje de células vivas en relación al valor de las muestras sin citoquina (medio). Los datos se normalizaron restando el dato de absorbancia medido en ausencia de CrmD para cada citoquina (sin CrmD).

0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

medio sin CrmD mLTα1β2 mLTα2β1 mLTα mTNFα mTRAIL

Su p er vi ve n ci a L 92 9

Así, se trabajó con células MOLT4 para la migración inducida por mCCL25, A20 para mCCL27, MonoMac1 para mCXCL12β y esplenocitos de ratón para mCXCL13 (Figura 18). Se observó que, en las condiciones de los ensayos, CrmD consiguió inhibir, de manera dosis dependiente, la quimiotaxis inducida por mCCL25, mCCL27 y mCXCL13, pero no por mCXCL12β, lo que sugiere que la unión de CrmD-CXCL12β (KD=16,6nM) no se da de manera eficaz para bloquear los efectos de la CK y por tanto carece de relevancia

biológica. Sin embargo, la migración mediada por mCCL25, mCCL27 y mCXCL13 quedó inhibida por CrmD, lo que confirmó la actividad anti-CK in vitro de esta proteína de ECTV. Así por ejemplo, excesos molares de CrmD respecto a la CK de 10, 25 y 100 veces, consiguieron reducir por debajo del 50% la migración inducida por mCCL25, mCCL27 y mCXCL13, respectivamente (Figura 18). En un experimento similar, CrmD inhibió la migración inducida en células A20 por mCXCL13 (Resultados no mostrados)